韌皮部桿菌亞洲種簡單重復(fù)序列(SSR)多態(tài)性及其侵染甜橙后轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、柑橘黃龍?。–itrus Huanglongbing，HLB）是一種系統(tǒng)性侵染的細(xì)菌性病害，是柑橘生產(chǎn)中最具破壞性的病害之一。柑橘植株感病后會(huì)出現(xiàn)下列癥狀:1、葉片斑駁狀黃化，后伴隨有均勻黃化或缺素型黃化，致樹梢黃化狀;2、果實(shí)沿中軸向一側(cè)歪斜，著色與正常果實(shí)相反，又稱“紅鼻果”，果小質(zhì)劣;3、樹勢變?nèi)?，后期易死亡。引起該病的病原暫定為韌皮部桿菌屬下三個(gè)種:韌皮部桿菌亞洲種（‘Candidatus Liberibacter asiati

2、cus’，CaLas），韌皮部桿菌非洲種(‘Ca.Liberibacterafricanus’，CaLaf)，韌皮部桿菌美洲種（‘Ca.Liberibacter americanus’，CaLam）。由于病原菌還不能人工純培養(yǎng)，目前仍然沒有完成病原的柯赫式證病實(shí)驗(yàn)，同時(shí)也給病原的深入研究造成了極大阻礙?，F(xiàn)在世界上各大柑橘產(chǎn)區(qū)，包括非洲、亞洲、北美洲和南美洲的近50個(gè)國家和地區(qū)都有發(fā)生。該病尚無有效防治藥劑，一旦植株染病，通常只能砍樹。該

3、病仍呈不斷蔓延之勢，產(chǎn)量過千萬噸的中國、巴西和美國均受到其嚴(yán)重威脅，倍受產(chǎn)業(yè)關(guān)注。
　　本文從以下三個(gè)方面展開研究:1、基于該菌培養(yǎng)“成功”的報(bào)道，驗(yàn)證和探索病原菌的人工培養(yǎng)方法;2、通過收集中國境內(nèi)不同地理來源的菌群，篩選SSR位點(diǎn)，研究群體結(jié)構(gòu);3、對甜橙感染CaLas后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)開展研究，取得如下結(jié)果。
　　1、對已報(bào)道三種實(shí)時(shí)檢測方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)Teixeira等所建立的方法穩(wěn)定性和靈敏性較好，不易出現(xiàn)假陽性的結(jié)

4、果，因此選定該方法作為病原培養(yǎng)時(shí)檢測方法。并針對該方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于定量監(jiān)測病原是否發(fā)生增殖。根據(jù)已報(bào)道培養(yǎng)方法和柑橘木質(zhì)部及韌皮部難培養(yǎng)菌培養(yǎng)方法，結(jié)合CaLas全基因組信息，進(jìn)行培養(yǎng)探索。經(jīng)過大量重復(fù)實(shí)驗(yàn)，未能重復(fù)成功，迄今也沒有其他實(shí)驗(yàn)室成功重復(fù)已有報(bào)道結(jié)果，以往“成功”報(bào)道，仍屬孤證實(shí)驗(yàn)。所試驗(yàn)8種培養(yǎng)基中，2G培養(yǎng)基可以最長時(shí)間檢測到病原，但并沒有觀察到明顯增殖，培養(yǎng)方法還需進(jìn)一步探索，找尋支持病原生長的關(guān)鍵因子。

5、　　2、對已報(bào)道SSR位點(diǎn)進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)位點(diǎn)在中國樣品中存在變異，這5個(gè)位點(diǎn)分析中國樣品時(shí)的Nei's多樣性指數(shù)H在0.1542～0.9556區(qū)間?；谶@5個(gè)SSR變異位點(diǎn)，對收集到的中國285份CaLas樣品進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，中國CaLas可明顯被分為兩個(gè)組群，東南地區(qū)樣品群體構(gòu)成以其中一組為主，西南地區(qū)以另一組為主。其中東南地區(qū)樣品兩個(gè)組群混雜程度高于西南地區(qū)，表現(xiàn)出各個(gè)省份混雜程度均高于西南地區(qū)。西南地區(qū)樣品群體構(gòu)

6、成相對單一，特別是云南和四川樣品，幾乎為同一種群組成，受到其它菌群影響較少。福建省樣品表現(xiàn)出一定的特殊性，地理位置上為中國東南地區(qū)，菌群構(gòu)成上卻和西南地區(qū)相近。不同組群間CaLas引起寄主癥狀都以斑駁狀黃化為主，暫時(shí)沒有觀察到癥狀上的分化。本研究還基于其中3個(gè)SSR位點(diǎn)，對中國和世界上其他部分國家CaLas樣品進(jìn)行了聚類分析，所有樣品被分為兩個(gè)組群:中國CaLas群體組成和巴西、印度和柬埔寨相似，但是中國樣品表現(xiàn)出更高的混雜性;美國菌群

7、主要為另一組群，構(gòu)成相對單一。
　　3、對感染CaLas的甜橙（Citrus sinensis）轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，篩選出1077個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，這些DEGs主要涉及植物的運(yùn)輸、碳水化合物代謝、光合作用及激素等方面。分析這些DEGs所涉及具體代謝途徑:蔗糖代謝途徑中蔗糖轉(zhuǎn)化酶上調(diào)4倍，果糖代謝途徑中果糖激酶下調(diào)2倍，淀粉分解代謝途徑中γ-淀粉酶被下調(diào)2倍。這些酶的變化可能會(huì)導(dǎo)致植物淀粉的積累，進(jìn)一步可能會(huì)導(dǎo)致植物可溶性糖，特

8、別是蔗糖的減少，造成植物營養(yǎng)供給不足。并未出現(xiàn)大規(guī)模的糖類相關(guān)代謝基因被差異表達(dá)，推測原因是因?yàn)榻臃N植株仍處于發(fā)病初期階段，因而糖類代謝并沒有出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂。與植物抗逆相關(guān)代謝途徑被激活，包括:1、緩解過氧化環(huán)境和抗逆相關(guān)的抗壞血酸合成途徑中相關(guān)基因被上調(diào)，2、植物激素中水楊酸信號(hào)途徑被激活，3、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、熱激蛋白等相關(guān)基因也都被上調(diào)表達(dá)，這些說明寄主通過各種途徑在抵御病原的進(jìn)一步侵染。植物光合作用中，光吸收復(fù)合體等相關(guān)基因被下調(diào)，

9、會(huì)影響植物的光合作用，植物激素中生長素和細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相關(guān)基因也被下調(diào)，這些差異表達(dá)可能會(huì)對植株的生長發(fā)育等造成負(fù)面影響。
　　4、選取敏感品種巖溪晚蘆椪柑品系(C.reticulata)和耐病品種卡里佐枳橙品系（Poncirus trifoliata），接種相同CaLas毒源，椪柑可在8周左右檢測到CaLas，15周時(shí)病原含量已較大，枳橙在相同時(shí)間段內(nèi)檢測不到病原或偶能檢測到極低濃度的存在。但是，在嫁接于枳橙的毒源芽段

10、發(fā)出的芽中可以檢測到病原，推斷枳橙對病原的擴(kuò)散具有一定的限制作用，CaLas較難在枳橙中增殖。在癥狀上，椪柑出現(xiàn)生長勢變?nèi)酢⑷~片變小、部分葉片黃化等癥狀，而枳橙未出現(xiàn)任何癥狀。選取光合作用、激素、鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑的DEGs，進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光合作用途徑中，耐病品系表現(xiàn)出更少的基因被下調(diào)，在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，有更多的抗逆相關(guān)途徑被激活。而且所驗(yàn)證的DEGs，多數(shù)在耐病品系中表達(dá)量更高，這些可能與其表現(xiàn)出的耐病