牡丹韌皮部蔗糖轉(zhuǎn)運機理研究及關(guān)鍵基因挖掘.pdf

1、牡丹（Paeonia suffruticosa）是眾人皆知的觀賞花卉，卻不適宜盆栽種植，大大阻礙了其工廠化育苗的步伐。本研究以鳳丹（Paeonia ostii）和芍藥(Paeonia broteri)為砧木嫁接的‘洛陽紅’牡丹(Paeonia suffruticosa‘Luo Yanghong’)為試材，研究了容器栽培條件下盆栽牡丹各生長發(fā)育階段的形態(tài)特征指標、可溶性糖組分的變化、蔗糖在植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)運路徑、蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（PsSUT2

2、）的克隆及表達以及與蔗糖轉(zhuǎn)運和代謝相關(guān)基因的挖掘等內(nèi)容，為拓寬牡丹栽培范圍、實現(xiàn)分子育種和遺傳改良提供理論和技術(shù)方面支持。主要研究結(jié)果如下:
　　1.形態(tài)特征指標
　　年生長周期中，兩種砧木嫁接的牡丹株高、冠幅變化趨勢相似，差異不顯著，而芍藥砧‘洛陽紅’新枝長、成花數(shù)量、花蕾的高度和直徑等均優(yōu)于鳳丹砧牡丹，差異顯著，芍藥砧牡丹較鳳丹砧牡丹更適宜用作容器栽培。
　　2.可溶性糖組分的變化
　　年生長周期中，蔗糖在鳳

3、丹砧牡丹葉片中的積累量明顯高于芍藥砧牡丹葉片（夏季休眠期除外），與鳳丹砧‘洛陽紅’成花數(shù)量少，庫強不足有一定關(guān)系;葉柄是蔗糖運輸?shù)闹饕ǖ?，有時也可以暫時貯存蔗糖;花后生長期是鱗芽積累蔗糖及生理代謝高峰期，因此花后增施磷鉀肥有利于牡丹的花芽發(fā)育;冬季休眠期兩根砧根和老莖是貯存蔗糖的主要器官，鳳丹砧老莖表現(xiàn)出比芍藥砧老莖更強的貯存蔗糖能力，芍藥砧老莖中蔗糖則更多地回流到根中貯存，而整個生長期芍藥砧根中蔗糖水平持續(xù)下降，為牡丹的生長源源不斷

4、地提供碳源物質(zhì);而在秋后生長期，當鳳丹砧‘洛陽紅’葉、葉柄和芽代謝活動基本停止的時候，芍藥砧‘洛陽紅’葉、葉柄和芽依然保持較高的代謝狀態(tài)，秋后生長期的延長更有利于芍藥砧葉片利用光合作用合成蔗糖流向根中貯存。
　　3.蔗糖在植株體內(nèi)的轉(zhuǎn)運途徑
　　CF（Carboxyfluorescein,羧基熒光素）熒光示蹤結(jié)果表明:生長期和即將休眠期，葉片主脈CF熒光被限制在韌皮部細胞內(nèi)，并未向周圍薄壁細胞擴散，說明主脈中SE/CC與PP

5、處于共質(zhì)體隔離狀態(tài);而葉柄、新莖、老莖、根中盡管CF熒光信號強弱不同，生長期和即將休眠期均可以觀察到CF熒光向周圍薄壁細胞擴散的情況，說明在‘洛陽紅’牡丹的運輸韌皮部（葉柄、新莖和老莖）中及貯藏器官（根）中，共質(zhì)體是廣泛聯(lián)系的，兩根砧牡丹間熒光示蹤結(jié)果未見明顯差異。
　　超微結(jié)構(gòu)觀察進一步顯示兩根砧牡丹的主脈、葉柄、花瓣、生長期的根、即將休眠嫁接部位、即將休眠的鳳丹根砧中胞間連絲數(shù)量較少，并觀察到篩管、伴胞細胞壁的內(nèi)突生長、壁旁體

6、和囊泡的出現(xiàn)，薄壁細胞胞間隙較大、內(nèi)部含有囊泡結(jié)構(gòu)等特征，意味著這些部位中同化物的轉(zhuǎn)運可能以質(zhì)外體途徑為主，以共質(zhì)體途徑為輔，而即將休眠期芍藥砧根中蔗糖轉(zhuǎn)運采取共質(zhì)體途徑。
　　4.蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因(PsSUT2)的克隆及表達
　　以‘洛陽紅’牡丹葉片為材料，利用RT-PCR和RACE方法從葉片中克隆了蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，將此基因命名為PsSUT2，GenBank登錄號為KC542396。該基因cDNA全長2347bp，編碼6

7、01個氨基酸，相對分子量為64.6KD，等電點為6.14，編碼的氨基酸序列與葡萄同源性最高，為75.27％。該蛋白有12個跨膜螺旋，屬于MFS蛋白家族。
　　采用實時熒光定量RT-qPCR法，分析了PsSUT2基因在鳳丹砧和芍藥砧‘洛陽紅’不同生育時期不同器官中的表達情況，結(jié)果表明PsSUT2在兩根砧牡丹的不同器官中表達趨勢相似，且主要在秋后生長期的葉、葉柄、鱗芽、新莖、老莖、根和盛花期的花瓣中表達，為該時期蔗糖在植株體營養(yǎng)器官和

8、生殖器官中的轉(zhuǎn)運做出積極貢獻。
　　5.蔗糖轉(zhuǎn)運及代謝相關(guān)基因的挖掘
　　通過新一代測序技術(shù)(RNA-seq)對小風(fēng)鈴期和盛花期‘洛陽紅’花瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，共有59616條unigenes被組裝，有33919條unigenes得到功能注釋，篩選得到差異表達基因共有4224個，其中有1886個上調(diào)表達，2338個下調(diào)表達。通過KEGG分析，共有698條差異基因歸為118條代謝途徑，其中碳代謝、淀粉與蔗糖代謝是主要的代謝途

9、徑，該途徑中表達量明顯發(fā)生變化的基因在牡丹開花過程中發(fā)揮著重要作用。測序結(jié)果顯示牡丹蔗糖轉(zhuǎn)運家族中PsSUT1基因上調(diào)表達，還發(fā)現(xiàn)了與蔗糖轉(zhuǎn)運有關(guān)的另一個新家族SWEET成員，其中8個基因差異表達（3個上調(diào)表達，5個下調(diào)表達）;參與蔗糖代謝的關(guān)鍵酶基因8個差異表達，其中轉(zhuǎn)化酶基因4個（2個上調(diào)表達，2個下調(diào)表達），蔗糖合成酶基因4個均上調(diào)表達，而蔗糖磷酸合成酶基因和PsSUT2未見差異表達。這17個差異表達的基因在‘洛陽紅’牡丹開花過程