堆型艾美耳球蟲pcDNA3-3-1E重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、雞球蟲病是由艾美耳球蟲引起的一種對(duì)雞危害極為嚴(yán)重的全球性寄生蟲病，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)該病的防治主要以化學(xué)合成藥及抗生素為主，由于長(zhǎng)期應(yīng)用易使雞群產(chǎn)生抗藥性，且在禽類產(chǎn)品中因有藥物殘留而影響人類健康。這使研究者將目標(biāo)轉(zhuǎn)移到了疫苗的研制方面，用分子生物學(xué)方法來預(yù)防球蟲病具有潛在的優(yōu)越性。本試驗(yàn)以雞堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina，E.acervulina）為研究對(duì)象，構(gòu)建了針對(duì)第二代裂殖子表面抗原3-1E

2、基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-3-1E，并用該重組質(zhì)粒作為DNA疫苗進(jìn)行了免疫試驗(yàn)，為研制高效、安全的抗球蟲疫苗和新藥物奠定了基礎(chǔ)。
　　 參考GenBank中收錄的E.acervulina美國(guó)株（US株）裂殖子3-1E基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，以保定株堆型艾美耳球蟲裂殖子RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法擴(kuò)增3-1E基因，經(jīng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物為689bp。將擴(kuò)增的 3-1E基因克隆至PGM-T Easy載

3、體，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞Top10，藍(lán)白斑法篩選出陽性重組子，提取陽性質(zhì)粒DNA并測(cè)序。序列分析結(jié)果表明，該株的3-1E基因序列與參考序列（US株）同源性達(dá)99.6％，表明其具有很高的保守性。
　　 以克隆質(zhì)粒PGM-3-1E為模板，擴(kuò)增3-1E基因閱讀框。將擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET28a(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-3-1E，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定，結(jié)果表明表達(dá)出的重

4、組蛋白分子量大小約為22kDa；經(jīng)Western blot鑒定結(jié)果表明該重組蛋白可被抗堆型艾美耳球蟲的多克隆抗體識(shí)別，說明其具有很好的反應(yīng)原性。
　　 將擴(kuò)增的3-1E基因閱讀框插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3-1E，pcDNA-3-1E經(jīng)酶切和PCR鑒定均為陽性，測(cè)序分析為正向插入。用堿裂解法大量提取重組表達(dá)質(zhì)粒，純化后作為核酸疫苗接種一周齡雛雞。分別設(shè)高(100μg)、中(50μg)

5、、低(25μg)三個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)3-1E重組蛋白免疫組、活卵囊接種組、非免疫感染組和健康對(duì)照組。在7日齡時(shí)首免，14日齡加強(qiáng)免疫，一周后用2.5×105個(gè)E.acervulina BD株球蟲孢子化卵囊進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示50μg的劑量可使試驗(yàn)雞產(chǎn)生較強(qiáng)的抗蟲效果：攻蟲后雞的卵囊產(chǎn)量下降67.67％，腸道病變記分降低66.96％，并使雞的相對(duì)增重率達(dá)88.36％，ACI值為167.06。
　　 將純化后重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3