絨山羊CRISPs的cDNA克隆、CRISP2的表達(dá)定位及其與PDIA3相互結(jié)合的研究.pdf

1、哺乳動物授精是一個多步驟的復(fù)雜過程,包括很多獨特的行為,有很多特異性蛋白或脂質(zhì)等分子的參與。其中蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)家族成員Pdia3(ERp57)和CRISP(cysteine-rich secretory proteins,CRISPs)家族蛋白參與了精卵融合,但是對于其介導(dǎo)精卵融合的分子機制尚不清楚。本實驗克隆了絨山羊CRISPs家族各成員蛋白的cDNA序列,制備了小鼠抗羊CRISP2多克隆抗體,用免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)

2、技術(shù)研究了CRISP2蛋白在睪丸中的的表達(dá)定位,并用免疫共沉淀和酵母雙雜交技術(shù)檢測了絨山羊CRISP2和Pdia3在細(xì)胞內(nèi)能否直接相互結(jié)合,以圖解析CRISP2和Pdia3在精卵融合中的分子機制。
　　 本研究首先設(shè)計保守性引物,采用RT-PCR方法成功克隆了絨山羊的 CRISP1、CRISP2、CRISP3 cDNA(同時也克隆到了綿羊的CRISP2、CRISP3 cDNA)?？寺〉降慕q山羊CRISPs蛋白長度均在240 aa

3、左右,均有20 aa左右長度的信號肽。將所得到的絨山羊和綿羊CRISPs氨基酸序列同GenBank和Ensemb1數(shù)據(jù)庫中公布的其它物種的CRISPs氨基酸序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)不同物種的CRISPs蛋白同源性較高,且有16個高度保守的半胱氨酸殘基,成為該家族的特征。將克隆得到的絨山羊的CRISP1、CRISP2、CRISP3 cDNA去信號肽序列后,分別構(gòu)建了pGEX-CRISP1、pGEX-CRISP2、pET44a-CRISP3原核表

4、達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白GST-CRISP1、GST-CRISP2、Nus-CRISP3。用純化的GST-CRISP2融合蛋白作為免疫原免疫昆明(KM)小鼠,最后腹腔注射S180細(xì)胞,制備了小鼠抗絨山羊CRISP2的腹水多克隆抗體,并采用戊二醛交聯(lián)法純化了自制的腹水多抗體。Western blotting分析顯示所制抗體能特異性識別組織中的CRISP2蛋白。免疫組織化學(xué)檢測絨山羊睪丸組織發(fā)現(xiàn)CRISP2蛋白大量出現(xiàn)于睪丸曲精細(xì)管內(nèi)側(cè)中