絨山羊CRISP2和PDIA3相互結(jié)合的研究.pdf

1、哺乳動物的精卵融合過程是個復(fù)雜而精巧的事件，需要一些特異性蛋白相互作用來介導(dǎo)。其中精子上的PDIA3(ERp57)是蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(proteindisulfideisomerase，PDI)家族的成員，具有催化二硫鍵的功能，CRISP2是富含半胱氨酸的分泌蛋白（cysteinesecretoryproteins，CRISPs）家族的成員，具有16個保守的半胱氨酸和它們所形成的復(fù)雜的二硫鍵，這兩種蛋白質(zhì)都參與了精卵的融合過程，但是到目

2、前為止這兩種蛋白質(zhì)在精卵結(jié)合與融合過程中的作用機制尚不清楚。我們猜測PDIA3可能會催化CRISP2分子中的二硫鍵從而引起其構(gòu)象發(fā)生改變而介導(dǎo)精卵融合。為了驗證這一想法，本實驗構(gòu)建了絨山羊PDIA3和CRISP2成熟肽和分段真核表達(dá)載體，用免疫共沉淀和酵母雙雜交技術(shù)檢測了PDIA3與CRISP2能否互相結(jié)合。
　　首先根據(jù)本實驗室克隆的絨山羊CRISP2(GU362703.1)和PDIA3的cDNA序列(GU985268.1)，分

3、析了它們的結(jié)構(gòu)特點及其功能域后，將其各分為兩段，即CRISP2A（24～176aa，去掉信號肽后）、CRISP2B(177～244aa)、PDIA3A（26～376aa，去掉信號肽后）和PDIA3B(377～505aa)段。在設(shè)計引物構(gòu)建pcDNA真核表達(dá)載體的時候，給PDIA3(26～505aa)、PDIA3A和PDIA3B的C端加了HA標(biāo)簽，CRISP2(24～376aa)、CRISP2A和CRISP2B的C端加了6His標(biāo)簽，使用

4、抗HA標(biāo)簽和His標(biāo)簽的單克隆抗體進(jìn)行免疫共沉淀。把構(gòu)建好的真核表達(dá)載體分成五組，即pcDNA-Pdia3和pcDNA-CRISP2、pcDNA-Pdia3A和pcDNA-CRISP2A、pcDNA-Pdia3A和pcDNA-CRISP2B、pcDNA-Pdia3B和pcDNA-CRISP2A、pcDNA-Pdia3B和pcDNA-CRISP2B。五組分別共轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞系，進(jìn)行了免疫共沉淀實驗。實驗結(jié)果顯示:PDIA3A可以分別和

5、CRISP2A、CRISP2B發(fā)生相互作用，而PDIA3B不能和CRISP2的任何一段發(fā)生作用。此外，用上述片段成功構(gòu)建了酵母雙雜交載體pGBK-Pdia3、pGBK-Pdia3A、pGBK-Pdia3B、pGAD-CRISP2、pGAD-CRISP2A和pGAD-CRISP2B，然后像免疫共沉淀載體一樣，也將酵母載體分成了五組，進(jìn)行了五組酵母雙雜交的實驗。酵母雙雜交的實驗結(jié)果顯示:PDIA3A可以分別和CRISP2A、CRISP2B發(fā)