木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表達(dá)的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用RT-PCR技術(shù),從木薯(Cassava)幼葉組織中擴(kuò)增出HNL全長cDNA序列,將其克隆至質(zhì)粒pBluescript SK(pBS)中進(jìn)行序列分析.結(jié)果表明:克隆的木薯(Cassava)HNL eDNA片段和文獻(xiàn)報(bào)道的4個(gè)木薯(Cassava)HNL cDNA相比,核苷酸同源性最高為99.1﹪,氨基酸同源性最高為98.8﹪.利用PCR擴(kuò)增和DNA重組技術(shù)將木薯(Cassava)HNL cDNA克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC3.5

2、K上,通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、高拷貝整合轉(zhuǎn)化子篩選、誘導(dǎo)發(fā)酵、SDS-PAGE分析和酶活測(cè)定等一系列步驟,證明在Pichia pastoris中成功表達(dá)了木薯(Cassava)HNL cDNA,每升發(fā)酵液可獲得5040個(gè)單位的HNL.為實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)和降低成本的目的,我們又嘗試在E. coli中表達(dá)木薯(Cassava)HNL cDNA.在克隆木薯(Cassava)HNL cDNA、DNA測(cè)序基礎(chǔ)上,將木薯(Cassava)HNL cDNA克隆

3、到原核表達(dá)載體pBV220上,構(gòu)建E.coli中表達(dá)質(zhì)粒pBV220-HNL,并利用CaCl<,2>轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α.含重組質(zhì)粒pBV220-HNL的大腸桿菌工程菌經(jīng)溫度誘導(dǎo)后,其表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在.經(jīng)SDS-PAGE分析及酶活測(cè)定的結(jié)果表明:木薯(Cassava)HNL cDNA在E. coli中成功表達(dá),所測(cè)最高酶活力為4540 U/L發(fā)酵液.以上工作為獲得大量HNL、深入研究其作用機(jī)理以及開展工業(yè)生產(chǎn)