高通量篩選和鑒定具ACC脫氨酶的細(xì)菌.pdf

1、植物在遭受脅迫時(shí)產(chǎn)生乙烯。高濃度乙烯抑制植物生長(zhǎng)。具1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸(ACC)脫氨酶的細(xì)菌能通過降解乙烯合成前體ACC而降低植物產(chǎn)生乙烯的水平。在惡化的農(nóng)田生態(tài)下，接種具ACC脫氨酶的細(xì)菌往往比接種具其他促植物生長(zhǎng)特性的細(xì)菌，如固氮菌，更易產(chǎn)生促植物生長(zhǎng)的效應(yīng)。于是，本研究致力于從固氮菌和能在無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌中篩選具ACC脫氨酶的細(xì)菌并應(yīng)用于農(nóng)作物生產(chǎn)。
　　 分離具ACC脫氨酶細(xì)菌通用的方法是用以ACC為唯一氮源的

2、基本培養(yǎng)基來篩選，但對(duì)于能在無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌，這種篩選方法顯然不夠靈敏。而對(duì)于從大量能在無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌中篩選具ACC脫氨酶的細(xì)菌則需要新的高通量篩選方法。本研究以乙二醇為溶劑加入抗壞血酸配制茚三酮試劑，在沸水浴上加熱聚丙烯96孔煙囪型PCR板中的反應(yīng)液，測(cè)定反應(yīng)后液體在570 nm處的吸光值計(jì)算ACC的濃度，建立了高通量的茚三酮-ACC比色法用于測(cè)定細(xì)菌對(duì)ACC的消耗。接著，以43個(gè)從甘蔗分離的固氮菌和68個(gè)從玉米分離的能

3、在無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株為材料，快速篩選到6個(gè)能消耗ACC的細(xì)菌，用2，4-二硝基苯肼比色法檢測(cè)證實(shí)這6個(gè)菌株都具有ACC脫氨酶活性。因此，高通量茚三酮-ACC比色法適合高通量篩選具ACC脫氨酶活性細(xì)菌。用該法進(jìn)一步從153個(gè)從甘蔗分離的能在無氮培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株和268個(gè)從水稻或東南景天分離的能在以ACC為唯一氮源的基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株中篩選出52個(gè)具ACC脫氨酶活性的細(xì)菌。
　　 在分子水平鑒定具ACC脫氨酶的細(xì)菌是通過用

4、簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因acdS或用DNA雜交檢測(cè)acdS。已發(fā)表的研究往往參考少數(shù)菌株的acdS序列設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增特異性差，還不如菌落雜交有效；而菌落雜交也需要針對(duì)不同類型的acaS用相應(yīng)類型的探針，探針的廣譜性弱。本研究根據(jù)ACC脫氨酶的蛋白結(jié)構(gòu)、氨基酸保守性分析及其與同源蛋白D-半胱氨酸脫巰基酶在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別，用CODEHOP法則設(shè)計(jì)了廣譜特異的acdS簡(jiǎn)并引物：CodehopACCf1、CodehopACCf2、C

5、odehopACCf3和CodehopACCr，并成功擴(kuò)增得到所有58株具ACC脫氨酶細(xì)菌的acdS基因片段，實(shí)現(xiàn)了在分子水平高通量鑒定具ACC脫氨酶的細(xì)菌。在這58株細(xì)菌的acdS基因片段中，有一些歸于新的acdS類群。而且，通過構(gòu)建所有已知具有ACC脫氨酶活性細(xì)菌的acdS和相應(yīng)16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹揭示了acdS存在廣泛的基因水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。
　　 本研究還對(duì)從玉米和水稻分離篩選的43株具ACC脫氨酶細(xì)菌的多種促植物生

6、長(zhǎng)特性包括分泌IAA、固氮、溶磷、分泌嗜鐵素和拮抗病原真菌做了分析，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌還具有一種以上其他促植物生長(zhǎng)的特性，顯示出促植物生長(zhǎng)的應(yīng)用潛能。其中16株伯克氏菌不僅能解磷和分泌嗜鐵素，而且具有廣譜的拮抗病原真菌的能力，但這些伯克氏菌在親緣關(guān)系上與包含機(jī)會(huì)致病菌的洋蔥伯克氏菌群接近。雖沒有從這些伯克氏菌中檢測(cè)到BCESM致病因子，但多數(shù)菌株對(duì)洋蔥有害。基因水平轉(zhuǎn)移acdS有可能使病原菌具有了ACC脫氨酶。因此，在應(yīng)用具ACC脫氨酶活性細(xì)