MDR逆轉(zhuǎn)劑高通量篩選模型的建立和應用.pdf

1、腫瘤多藥耐藥是指腫瘤細胞對多種結(jié)構和功能完全不相關的藥物產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象，是目前腫瘤化療成功的主要障礙之一。許多腫瘤對化療藥物具有先天的抵抗作用，而其它一些癌癥在接受化療后也會產(chǎn)生獲得性耐藥現(xiàn)象，這種多藥耐藥現(xiàn)象會減輕大多數(shù)化療藥物的藥效，成為了臨床化療成功的瓶頸。因此，腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究與開發(fā)已成為抗腫瘤研究的首要任務。 臨床出現(xiàn)的腫瘤多藥耐藥由多種因素所導致：在機體水平上，人體對藥物的吸收、分布、代謝及消除特性會引起藥效

2、的降低；在組織水平上，腫瘤組織特殊的幾何結(jié)構、通透性及其周圍特殊的酸性環(huán)境也會阻止藥物進入腫瘤組織；在細胞水平上，藥物靶蛋白的突變、代謝通路的改變及解毒蛋白的高表達也會使腫瘤細胞逃避化療藥物的殺傷，在細胞水平多藥耐藥中，由于腫瘤細胞高表達ABC蛋白家族的成員蛋白并通過外排泵作用降低胞內(nèi)藥物濃度所引起的多藥耐藥現(xiàn)象被稱為經(jīng)典腫瘤多藥耐藥。在過去的幾十年中，人們對腫瘤多藥耐藥的研究一直集中于對經(jīng)典多藥耐藥的研究。 P-gp是第一個被

3、證明能引起經(jīng)典多藥耐藥的外排泵蛋白，隨后，MRP、BCRP等ABC蛋白家族蛋白也相繼被證明與經(jīng)典多藥耐藥相關。而P-gp一直是研究最深入的蛋白，也是腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑開發(fā)的主要靶點。迄今為止，以P-gp蛋白的外排功能為靶點的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑已經(jīng)經(jīng)歷了三代歷程，包括鈣離子通道阻滯劑、鈣調(diào)蛋白抑制劑、免疫抑制藥物等P-gp功能抑制劑，但由于毒副作用和交叉藥代動力學反應等因素臨床效果不佳，并未開發(fā)出理想的逆轉(zhuǎn)劑上市；近幾年，越來越多的學者關注于

4、P-gp編碼基因mdrl的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，希望在轉(zhuǎn)錄水平抑制P-gp的高表達降低P-gp的外排作用以逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥。 本研究的目的是以mdrl基因啟動子和P-gp蛋白為靶點，基于報告基因技術和熒光染料胞內(nèi)積累實驗技術建立穩(wěn)定性好、靈敏度高的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑高通量篩選模型，為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的高通量篩選工作建立平臺，并對中藥樣品庫進行高通量篩選，尋找具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性的中藥樣品。在P-gp蛋白功能抑制劑篩選模型中，培養(yǎng)P-g

5、p高表達的MCF-7/ADM多藥耐藥抗性細胞株，用熒光染料Rho123為指示劑檢測P-gp外排功能情況以計算樣品對P-gp蛋白功能的抑制活性，并對中藥樣品庫進行了高通量篩選，再用劑量一活性依賴實驗和抗性增敏實驗驗證陽性樣品的活性；在mdrl啟動子抑制劑篩選模型中，首先以人肝癌細胞：HepG2基因組為模板，PCR擴增mdrl啟動子-434-+158區(qū)，構建mdrl-luc+重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2中，通過檢測啟動子下游熒光素酶報告基因的

6、表達情況計算樣品對啟動子的抑制活性，并對中藥樣品庫進行了高通量篩選，再用劑量依賴實驗和RT-PCR驗證陽性樣品的活性。 經(jīng)過實驗優(yōu)化，P-gp蛋白功能抑制劑篩選模型Z’因子為0.72，mdrl啟動子抑制劑篩選模型Z’因子為0.65，證明模型穩(wěn)定性好、靈敏度高。通過對中藥樣品庫的篩選，分別鑒定兩種中藥樣品具有較高的體外活性。 本研究工作為腫瘤逆轉(zhuǎn)劑的篩選與開發(fā)建立了平臺，使腫瘤逆轉(zhuǎn)劑的大規(guī)模高通量篩選成為可能。然而，更新更