基于GABABR的高通量藥物篩選模型的建立.pdf

1、GABAB受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體C家族，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中。GABAB受體通過(guò)與其配體GABA結(jié)合，介導(dǎo)緩慢而持久的抑制性神經(jīng)信號(hào)。過(guò)度激活或抑制受體，都會(huì)引起如認(rèn)知、疼痛、焦慮、抑郁、癲癇、藥物成癮、精神分裂等疾病的發(fā)生。GABAB受體由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、精細(xì)的激活機(jī)制和疾病的相關(guān)性，被認(rèn)為是最有藥理學(xué)意義的藥物靶點(diǎn)。針對(duì)GABAB受體為靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)主要集中于受體的激動(dòng)劑、拮抗劑以及變構(gòu)劑。開(kāi)發(fā)GABAB受體特異性

2、的調(diào)節(jié)劑，有利于GABAB受體的生理病理的研究，促進(jìn)相關(guān)疾病的治療。以GABAB受體為靶點(diǎn)的高通量藥物篩選模型的建立，有利于篩選出GABAB受體的特異性調(diào)節(jié)劑，作為先導(dǎo)藥物分子，為后續(xù)相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)，提高了藥物開(kāi)發(fā)的效率和速度。
　　本文主要以GABAB受體為藥物靶點(diǎn)，建立基于該靶點(diǎn)的高通量藥物篩選模型。將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的Gqi9片段重組到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，得到的重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染到本實(shí)驗(yàn)室已有的穩(wěn)定表達(dá)

3、GABAB受體的Flp-in CHO細(xì)胞系中，利用抗生素篩選及Ca2+信號(hào)檢測(cè)的方法，得到了GABAB受體和Gqi9共表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系。并使用該受體的配體GABA和拮抗劑CGP54626對(duì)其進(jìn)行了功能驗(yàn)證以及穩(wěn)定性檢測(cè)等。最終獲得了可以共表達(dá)GABAB受體和Gqi9的穩(wěn)定高通量藥物篩選模型。此外，也將時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（TR-FRET）應(yīng)用于藥物篩選中，建立基于SNAP和CLIP標(biāo)記的TR-FRET檢測(cè)的GABAB受體藥物篩選

4、模型。將SNAP標(biāo)記的GB1和CLIP標(biāo)記的GB2以及SNAP-GB1和GB2 C-tail帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)KKTN的SNAP-GB2-KKTN，分別轉(zhuǎn)染到Flp-inCHO細(xì)胞中，通過(guò)抗生素篩選、ELISA和Ca2+信號(hào)檢測(cè)的方法，獲得了一些既能上膜表達(dá)又能激活下游Ca2+信號(hào)的SNAP-GB1+CLIP-GB2和SNAP-GB1+CLIP-GB2-KKTN的克隆，用于下一步TR-FRET檢測(cè)，最終建立成基于GABAB受體的高通量藥