Glucagon受體模型的建立與高通量藥物篩選.pdf

1、化合物活性篩選是藥物創(chuàng)新研究的起點和具有決定意義的步驟，是源頭創(chuàng)新和持續(xù)創(chuàng)新的關(guān)鍵，離開篩選就無從發(fā)現(xiàn)具有某種特定生物活性的新型化學(xué)物質(zhì)，新藥的研究開發(fā)就將成為無源之水。但是，這種基本技術(shù)能力恰恰是我國創(chuàng)新藥物研制中最為突出的薄弱環(huán)節(jié)，成為制約醫(yī)藥工業(yè)轉(zhuǎn)型的"瓶頸"之一。傳統(tǒng)的動物篩選模式勞動強度大、效率低，近年來，隨著分子生物學(xué)、分子藥理學(xué)和自動化技術(shù)的發(fā)展，高通量藥物篩選(High throughput screening, HTS

2、)成為藥物早期發(fā)現(xiàn)的重要手段。它是利用藥靶的分子或細(xì)胞水平的生物學(xué)機制，以微孔板為基礎(chǔ)進(jìn)行大量篩選，找到能選擇性作用于藥靶的活性化合物，具有微量、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點。 人胰高血糖Glucagon Receptor (GCG-R)能夠活化腺苷酸環(huán)化酶，通過Gs型蛋白偶聯(lián)GTP使細(xì)胞內(nèi)信號完成表達(dá)。胰高血糖素具有活化磷脂酶C，并通過肌醇磷酸鹽通道導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+流失，升高血糖的生理學(xué)功能， GCG-R偶聯(lián)Ca2+流失，經(jīng)Gs通

3、道激活腺苷酸環(huán)化酶激活了其信號轉(zhuǎn)道通路。GCG-R的拮抗劑可能是治療2型糖尿病的有效藥物。為了進(jìn)一步了解GCG-R的生理學(xué)功能和開展抗2型糖尿病新藥研究，作者建立了GCG-R拮抗劑的高通量篩選模型，并以天然產(chǎn)物為資源，篩選了GCG-R的拮抗劑。 建立了人GCG-R基因質(zhì)粒(GCG-R/ pcDNA3.1)和一個能同時響應(yīng)Gs、Gi和Gq受體的報告基因質(zhì)粒(MRE/CRE/SRE/LUC)，并將GCG-R質(zhì)粒和報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到

4、HEK293細(xì)胞、SH細(xì)胞、CHO細(xì)胞、Hela細(xì)胞等，通過G418篩選，建立了穩(wěn)定的GCG-R受體拮抗劑篩選細(xì)胞株，并選出最優(yōu)的CHO細(xì)胞株作為篩選用細(xì)胞株。當(dāng)化合物與膜表面的GCG-R結(jié)合后，抑制GCG-R對應(yīng)的信號級聯(lián)反應(yīng)，改變胞內(nèi)第二信使的表達(dá)水平，響應(yīng)元件響應(yīng)這種變化，促進(jìn)報告基因的表達(dá)。通過檢測細(xì)胞質(zhì)中報告基因的表達(dá)量，間接評估化合物的生物活性 。 為了有效排除篩選過程中的假陽性和假陰性，同時建立了只含報告基因質(zhì)粒的

5、陰性細(xì)胞株。 利用 cAMP響應(yīng)元件CRE的激活劑Forskolin和受體內(nèi)源激動劑Glucagon探索和優(yōu)化了熒光素酶表達(dá)時間、每孔細(xì)胞數(shù)目、溶劑DMSO終濃度、熒光素酶底物濃度等篩選實驗條件，建立了可靠的篩選方法。實驗結(jié)果表明，GCG-R細(xì)胞株用于高通量篩選的條件為：細(xì)胞數(shù)目4′104個/孔，激動劑孵育時間為6h，每孔DMSO終濃度小于1％，熒光素酶底物終濃度為12.5％(V％),其系統(tǒng)Z’因子為0.74，適用于GCG-R拮