微液滴酶反應器超高通量篩選體系的建立.pdf

1、酶是高效、高選擇性、環(huán)境友好的生物催化劑，在化工、醫(yī)藥、能源、食品、環(huán)保等領域發(fā)揮著日益重要的作用，工業(yè)生產對酶的種類和性能的要求也越來越多樣化。利用宏基因組技術從天然環(huán)境中挖掘新酶基因，以及利用分子定向進化技術對現(xiàn)有酶制劑進行分子改造，是獲得性質優(yōu)良的新酶源的主要途徑。高通量篩選方法可以對大容量基因文庫進行高效篩選，是從酶突變庫及環(huán)境宏基因組庫中獲得極少數(shù)所需個體的核心關鍵技術，因此受到國際學術界的廣泛關注。
　　基于單細胞微反

2、應器的酶超高通量篩選體系是近年來新興的技術體系，它在皮升級的微液滴中進行單細胞酶反應，并通過流式細胞儀或微流控芯片進行分析和篩選，其篩選通量可高達108/天。而且，由于微反應器的體積比常規(guī)微孔板體系減少了百萬倍以上，從而大大降低了篩選的試劑成本。然而，基于單細胞微反應器的酶篩選技術目前仍存在一系列問題，表現(xiàn)為：（1）基于微液滴的微反應器均一度較差，從而影響酶活性定量及篩選效率；（2）用于微反應器檢測和分選的流式細胞儀價格昂貴，限制了該體

3、系的廣泛應用；（3）由于篩選底物種類較少，可用微反應器篩選體系進行篩選的酶種類有限。為解決上述問題，本論文開展了以下工作：
　?。?）高均一度的單細胞“水-油-水”微反應器制備：針對常規(guī)勻漿法制備微反應器均一度差的缺點，本論文利用膜擠出儀開發(fā)了新的“水-油-水”微液滴制備方法，生成的微液滴均一度顯著提高，從而極大地提高了酶活性定量的準確度，能夠有效區(qū)分酶活性差別在2倍以內的樣品。本論文利用該體系，成功實現(xiàn)了嗜熱酯酶 AFEST的定

4、向進化：通過對容量達200萬的隨機突變庫進行僅一輪篩選，便獲得了酶活性提高了兩倍的陽性突變體，其催化效率接近分子擴散效率的極限。突變體保持了野生型酶優(yōu)良的熱穩(wěn)定性及拓寬的底物譜，對藥物中間體7-氨基頭孢烷酸的水解活性也提高3倍，體現(xiàn)了該酶在頭孢類抗生素的酶法合成中的工業(yè)應用潛力。
　?。?）基于微流控芯片的“水-油”微反應器雙色熒光分選：微流控芯片具有成本低、體系靈活等優(yōu)點，能夠在極小的體積上整合液滴生成、操縱、分析等整套功能，為

5、酶高通量篩選帶來了新的契機。本論文開發(fā)了基于微流控芯片的“水-油”微反應器雙色熒光檢測分選體系，可同時考察兩種熒光信號變化，篩選通量高達1400/秒，在酶的底物特異性、立體選擇性、區(qū)位選擇性等功能的篩選中具有重要應用潛力。應用該體系，本論文成功對酯酶AFEST的立體選擇性進行了定向進化，獲得了對重要抗炎藥物S型異丙基布洛芬活性和立體選擇性都顯著提高的陽性突變體。
　?。?）“熒光微液滴捕獲”底物設計策略：為了提高微反應器篩選體系在