金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡及其信號(hào)通路的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）感染造成持續(xù)性奶牛乳房炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未徹底闡明。牛乳腺上皮細(xì)胞是病原菌穿越乳導(dǎo)管進(jìn)入牛乳腺后首先接觸的細(xì)胞，其與病原微生物的相互作用對于疾病的發(fā)展進(jìn)程和轉(zhuǎn)歸有非常重要的意義。許多病原微生物能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，并以此影響疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。金黃色葡萄球菌可以誘導(dǎo)單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而逃避免疫監(jiān)視，加重機(jī)體感染。金黃色葡萄球菌感染造成奶牛持續(xù)性乳房炎是

2、否與其誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，目前未見相關(guān)報(bào)道。
　　本研究以3株金黃色葡萄球菌感染牛乳腺上皮細(xì)胞為模型，觀察不同金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡情況，檢測金黃色葡萄球菌毒力因子與其誘導(dǎo)牛乳腺細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上，探索金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，以期為金黃色葡萄球菌持續(xù)性牛乳房炎發(fā)病機(jī)理解析、抗細(xì)菌藥物設(shè)計(jì)和疫苗研制提供理論依據(jù)。
　　首先，采用乳汁分離法和膠原酶消化法分離培養(yǎng)牛乳腺

3、上皮細(xì)胞，并通過細(xì)胞免疫熒光染色法、RT-PCR及核型分析鑒定牛乳腺上皮細(xì)胞;其次，用金黃色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮細(xì)胞，采用普通光鏡、掃描和透射電子顯微鏡、細(xì)胞核染色法觀察金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，并通過流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV/PI雙染法)定量檢測金黃色葡萄球菌感染對牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用;再次，通過對試驗(yàn)所用3株金黃色葡萄球菌的抗藥性、生長特性、溶血性、粘附和侵襲性能進(jìn)行檢測，探索其與牛乳腺上皮細(xì)胞

4、凋亡的相關(guān)性;最后，通過ELISA檢測感染前后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase1/3/8/9的活性變化，并用Real-timePCR檢測感染前后牛乳腺上皮細(xì)胞死亡受體Fas及其下游FADD的表達(dá)情況，死亡配體TRAIL、Ap03L及LTα的表達(dá)情況，IL-1β及TNF-α的表達(dá)情況，探討金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
　　得出如下結(jié)果:1）建立了從牛乳汁及乳腺組織中分離培養(yǎng)牛乳腺上皮細(xì)胞的方法。乳汁分離法相對組

5、織培養(yǎng)法而言，取材便捷并可有效縮減成本，亦可獲得純凈的牛乳腺上皮細(xì)胞;2）證明金黃色葡萄球菌可以誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡;3）證明金黃色葡萄球菌對牛乳腺上皮細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)能力與菌株的個(gè)體差異有關(guān)，其溶血性與侵染性可能與牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡有一定的相關(guān)性;4）初步證明金黃色葡萄球菌可能通過Fas-FADD-caspase8-caspase3凋亡傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體細(xì)胞色素C-caspase9與caspasel-IL