基于分子印跡固相萃取技術(shù)的食品中氯霉素類抗生素檢測技術(shù)研究【開題報告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開題報告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　基于分子印跡固相萃取技術(shù)的食品中氯霉素類抗生素檢測技術(shù)研究</p><p>　　一、選題的背景與意義</

2、p><p>　　氯霉素類抗生素是一種廣譜抗菌藥，開始因?yàn)槠涑杀镜?、抗菌效果好而被廣泛用于各種動物性疾病的防治。后應(yīng)發(fā)現(xiàn)其對人類的健康存在很大的威脅，有很大的毒副作用，氯霉素能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥。長期微量攝入氯霉素會引起動物機(jī)體正常菌群失調(diào)，抵抗力下降，易感染各種疾病。所以全球很多國家都已禁止使用。在這壓力下還是有一部分商家還在使用該類抗生素。而且其在食品中的含量是屬于痕量，這對氯霉素類抗生素的檢

3、測技術(shù)就有這很大的要求。</p><p>　　其檢測技術(shù)在前處理上有很大的不足。傳統(tǒng)的樣品前處理如液液萃取、索氏提取、固相萃取，存在使用大量溶劑、處理時間長、操作繁瑣等缺點(diǎn)，而且選擇性大多不是很高，選擇性高的有價格昂貴，不便于大量檢測，在整個分析過程中易出現(xiàn)誤差。檢測儀器都是貴重儀器，所以在整個檢測過程中樣品的前處理過程成為重點(diǎn)改進(jìn)對象。</p><p>　　而分子印跡固相萃取技術(shù)的出現(xiàn)成

4、為了一大突破口，它是將模板分子和有適合官能團(tuán)的功能單體相互作用，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑的作用下形成聚合物，通過溶劑洗脫解除去模板分子，聚合物中就留下了空間，這樣的空間便可以與混合物中待分離的分析物進(jìn)行可逆的特異性結(jié)合，從而達(dá)到分離、純化、富集的目的。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b></p

5、><p>　　1、獲得針對氯霉素類抗生素特異的分子印跡聚合物。</p><p>　　2、將獲得的分子印跡聚合物制備成分子印跡固相萃取小柱。</p><p>　　3、氯霉素類分子印跡聚合物在實(shí)際樣品中的應(yīng)用</p><p>　?。?）固相萃取條件的優(yōu)化</p><p>　　（2）樣品處理：上樣/淋洗/洗脫。</p>

6、;<p>　?。?）建立蝦樣品中氯霉素類抗生素的基于分子印跡固相萃取技術(shù)的檢測方法。</p><p><b>　　解決的主要問題：</b></p><p>　　1、獲得對氯霉素類抗生素特異的分子印跡聚合物；</p><p>　　2、獲得可高效分離純化蝦樣品中氯霉素類抗生素的分子印跡固相萃取條件。</p><p&

7、gt;　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　研究方法：</b></p><p>　　采用本體聚合法合成對氯霉素類抗生素具有特異選擇性和親和性的分子印跡聚合物；并準(zhǔn)確稱取25.0 mg的分子印跡聚合物，濕法裝柱（3 mL固相萃取小柱），填料的頂端和底端分別裝有20 µm孔徑的聚四氟乙烯篩板，制備成固相萃取小柱；進(jìn)一步通過對上樣、淋洗和洗脫

8、步驟的優(yōu)化，結(jié)合分子印跡固相萃取技術(shù)和HPLC等方法，實(shí)現(xiàn)對蝦樣品中氯霉素類抗生素的高選擇性、高靈敏性富集和檢測方法。 </p><p><b>　　技術(shù)路線：</b></p><p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度：</p><p>　　2010年11月—2010年12月：</p><p>　　1、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：查找

9、資料，寫開題報告。</p><p>　　2、儀器、藥品的準(zhǔn)備和各種實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備。</p><p><b>　　3、進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。</b></p><p>　　2010年12月—2011年3月：</p><p>　　1、分子印跡聚合物的制備。</p><p>　　2、分子印跡固相萃取柱的制備。<

10、;/p><p>　　3、分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化。</p><p>　　4、建立基于分子印跡固相萃取技術(shù)的氯霉素類抗生素的檢測方法。</p><p>　　2010年3月—2010年5月</p><p>　　1、補(bǔ)充相關(guān)數(shù)據(jù)，整理試驗(yàn)結(jié)果。</p><p><b>　　2、撰寫論文。</b></

11、p><p><b>　　3、論文定稿。</b></p><p><b>　　主要參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] 陳鵬, 羅曉琴. 氯霉素殘留狀況及檢測方法[J]. 動物保健, 2006, 18(10): 41-42</p><p>　　[2] 陳眷華, 彭羽. 氯霉素類抗生素藥物對人類健

12、康的威脅[J]. 貴州畜牧獸醫(yī), 2006, 30(4): 17-18</p><p>　　[3] 李秀萍, 尉新華, 孫艷霞. 淺談氯霉素的危害與控制[J]. 中國動物檢疫, 2003, 20(5): 18</p><p>　　[4] 宋杰, 宋燕青, 王勇鑫, 等. 微生物法在檢測牛奶中氯霉素殘留的應(yīng)用[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報, 2005, 29(1) : 85-91</p&g

13、t;<p>　　[5] 戴華, 王美玲, 李擁軍, 等. 飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的HPLC測定方法[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 2006, 23(6): 1209-1212</p><p>　　[6] Pilar V, Nuria B. Determination of chloramphenicol residues in animal feeds by liquid chloramph

14、enicol in milk[J]. J Assoc Off Anal Chem, 1980, 63(5): 1044-1048</p><p>　　[7] Jacobson W.C, Allen E.H, Wisemen H.G. Determination of Chloramphenicol in Liver, Kidney, Muscle, and Whole Blood[J]. Presented at

15、 88th Annual Meeting of AOAC, 1974,20(10): 14-17</p><p>　　[8] 彭莉, 程江, 高嵐, 等. 牛奶中氯霉素殘留的氣相色譜測定法研究[J]. 中國獸藥雜志, 2006, 40(9): 14-17</p><p>　　[9] 宮向紅, 徐英江, 張秀珍. 水產(chǎn)品中氯霉素殘留量氣相色譜檢測方法的探討[J]. 食品科學(xué), 2006, 2

16、7(7): 222-224</p><p>　　[10] 鐘惠英, 楊家鋒, 徐開達(dá). 氣相色譜法定量分析水產(chǎn)品中的氯霉素(CAP)殘留量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2006, 16(2): 183-185</p><p>　　[11] 洪振濤, 張衛(wèi)鋒, 聶建榮, 等. 氣相色譜法測定動物組織中氯霉素的殘留量[J]. 中國獸藥雜志, 2006, 40(2): 14-16</p&g

17、t;<p>　　[12] 周金慧, 張素霞, 沈建忠, 等. 雞組織中氯霉素殘留的氣相色譜-微電子捕獲檢測方法研究[J]. 中國獸藥雜志, 2006, 40(1): 16-19</p><p>　　[13] 李鵬, 邱月明, 蔡慧霞, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定動物組織中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的殘留量[J]. 色譜, 2006, 24(1): 14-18</p><p&

18、gt;　　[14] 陳小霞, 岳振峰, 吉彩霓, 等. 高效液相色譜-電噴霧電離三級四極桿質(zhì)譜測定雞肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的殘留量[J]. 色譜, 2005, 23(1): 92-95</p><p>　　[15] Masahiko T, Shigeki D, Taketoshi N. Determination of chloramphenicol residues in fish meats by

19、liquid chromatography -atmospheric pressure photoionization mass spectrometry [J]. Journal of Chromatography A, 2003, 1011(1-2): 67-75</p><p>　　[16] 郝俊虎, 王仙琴, 閏永利, 等. 酶聯(lián)免疫吸附法檢測雞肝腎中氯霉素殘留的分析[J]. 中國家禽學(xué)報, 2004,

20、8(1): 62-64</p><p>　　[17] 沈美芳, 趙文亞, 費(fèi)志良, 等. 用酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量[J]. 南京師范大學(xué)學(xué)報(工程技術(shù)版), 2003, 3(2): l-4</p><p>　　[18] 倪梅林, 章再婷, 李佐卿. 蝦仁中氯霉素殘留量的放射免疫測定[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2006, 16(10): 1266-1280</p>

21、<p>　　[19] 黃曉蓉, 鄭晶, 楊方, 等. 放射性受體免疫法分析方法快速篩選檢烤鰻中氯霉素殘[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖2003, 24(4): l6-18</p><p>　　[20] 徐美奕, 孟慶勇. 養(yǎng)殖對蝦中氯霉素殘留的放射免疫分析[J]. 水利漁業(yè), 2003, 23(6): l4-15</p><p>　　[21] 李余動, 張少恩, 吳志剛, 等. 膠體金免疫

22、層析法快速檢測氯霉素殘留[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2005, 17(5): 416-419</p><p>　　[22] 白艷玲, 陳劍剛, 張彩虹, 等. 水產(chǎn)品中氯霉素殘留量測定方法的研究[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2005, 15(6): 672-674</p><p>　　[23] 潘瑩宇, 許茜, 康學(xué)軍, 等. 高效液相色譜-熒光檢測法測定牛奶中氯霉素的殘留量[J].

23、色譜, 2005, 23(6): 577-580</p><p>　　[24] 陳天豹, 鄧文漢, 盧菀華, 等. 毛細(xì)管電泳法檢測蜜蜂中殘留的抗生素[J]. 2001, 19(1): 91-93</p><p>　　[25] 謝孟峽, 劉媛, 邱月明, 等. 固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜測定動物組織中氯霉素的殘留量[J]. 分析化學(xué), 2005, 33(1): 1-4</p>

24、<p>　　[26] Christina Schirmer, Hans Meisel. Synthesis of a molecularly imprinted polymer for the selective solid-phase extraction of chloramphenicol from honey[J]. J Chromatogr A, 2006, 1132(1): 325-328</p>&

25、lt;p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　食品中氯霉素類抗生素的檢測技術(shù)的研究</p><p>　　摘要：本文就分子印跡固相萃取技術(shù)、氯霉素類抗生素檢測方法，包括微生物學(xué)法、高效液相色譜法、氣相色譜法、色譜—質(zhì)譜連用法、放射免疫分析法、酶免疫分析

26、法等做一概述。</p><p>　　關(guān)鍵詞：氯霉素；檢測；分子印跡固相萃取技術(shù)</p><p>　　氯霉素最初是從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取的，是一種有效的廣譜抗生素。曾因其對多種病原菌的較強(qiáng)的抑菌作用而被廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)。后來人們逐漸發(fā)現(xiàn)其對人類有很大的毒、副作用，能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥以及新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等。長期微量攝入氯霉素會引起動物機(jī)體正常菌群失調(diào)，抵抗

27、力下降，易感染各種疾病, 許多國家已經(jīng)相繼禁止或嚴(yán)格限制使用氯霉素[1-3]，但由于氯霉素抑菌效果好，價格低廉，目前違法使用的現(xiàn)象還有發(fā)生，因此，建立高靈敏度、特異性強(qiáng)、簡便易行而又經(jīng)濟(jì)的氯霉素殘留的分析方法已經(jīng)成為一項(xiàng)迫切的任務(wù)。</p><p>　　1 氯霉素類抗生素檢測方法</p><p>　　氯霉素分析檢測方法的研究始于二十世紀(jì)七八十年代, 到目前為止, 國內(nèi)外用于氯霉素檢測的方法

28、已近十幾種, 其中主要有微生物法、儀器分析法和免疫分析法等。下面進(jìn)行對這些檢測方法進(jìn)行了綜述。</p><p><b>　　1.1 微生物學(xué)法</b></p><p>　　微生物學(xué)法的原理是利用特定菌株與藥物的作用來檢測樣品中CAP的種類和含量。常用于動物性食品獸藥殘留的初篩。有人用試紙法、棉簽法、發(fā)酵法等微生物法來檢測牛奶中氯霉素的殘留, 其中試紙法的靈敏度可達(dá)3

29、μg/L[4]。但是可以看出靈敏度不夠高。還有人用用藤黃八疊球菌菌株作為對氯霉素的敏感菌對魚肉組織中殘留的氯霉素進(jìn)行檢測時的結(jié)果是：檢測限為0.25 μg/g，平均回收率為67.5 %。它的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、樣品用量少、預(yù)處理簡單、快速、費(fèi)用低，適合大規(guī)模的定性篩選工作。缺點(diǎn)為靈敏度低、易漏檢、結(jié)果一出現(xiàn)假陽性、檢出限高。</p><p>　　1.2 高效液相色譜法(HPLC)</p><p&g

30、t;　　高效液相色譜法檢測氯霉素是一種靈敏度較高、可靠性較強(qiáng)的方法，此法重復(fù)性好、假陽性少，可以進(jìn)行定量鑒定。其中靈敏的差異與其所連檢測器的不同而不同。戴華等就曾用HPLC法測定飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量[5]。而Pilar等在檢測動物性食品中氯霉素殘留實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)其檢測限為0.7 μg/kg[6]。如果采用熒光檢測器時，靈敏度就有所提升，鄒月利在用該法測定奶中氯霉素殘留量的實(shí)驗(yàn)中的方法檢測限可達(dá)0.1 μg/L，回收率在96

31、.7 %-102.7 %。它的優(yōu)點(diǎn)是精確可靠、重復(fù)性好、靈敏度高、假陽性少。其缺點(diǎn)是處理過程復(fù)雜、耗時長、成本高、分析速度慢、回收率偏低，不適合用于大規(guī)模的樣品檢測。</p><p>　　1.3 氣相色譜法(GC)</p><p>　　氯霉素氣相色譜檢測法最早是在1974年AOAC會上由Jacobson等人提出的[7]。目前氣相色譜法分析氯霉素檢測限一般在0.1 μg/kg左右[8-12]

32、。在樣品提取后衍生化在用氮吹干、定容的方法進(jìn)行氣相色譜檢測這方面存在著一定的爭議，惠英等在其實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)衍生后不用氮吹干，而加大定容劑量，這樣檢測的結(jié)果更好[10]。它的優(yōu)點(diǎn)是分離效能高、選擇性高、靈敏度高和檢測迅速。其缺點(diǎn)是繁瑣的衍生步驟，儀器化程度高且價格貴，不適在基層推廣使用。</p><p>　　1.4 色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法</p><p>　　1.4.1 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS

33、)已成熟的運(yùn)用于分析食品中氯霉素類抗生素殘留的檢測，這類方法一般都用硅烷化試劑對殘留物衍生，然后用不同的離子源使衍生物破碎成相應(yīng)的離子進(jìn)行定性和定量分析。實(shí)例：李鵬等在用(GC-MS)法檢測動物組織中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的殘留量時其中氯霉素的檢測限達(dá)到了0.03 μg/kg,回收率為80 %-111.5 %[13]。此方法有一不足就在于必須進(jìn)行衍生反應(yīng)。</p><p>　　1.4.2 液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用

34、(LC-MS)是目前美國FDA推薦的氯霉素檢測方法。它有著取代GC-MS法的趨勢。實(shí)例：陳小霞等在用此方法測定雞肉中氯霉素殘留量時，檢出限為10 ng/kg[14]。Masahiko等也用此法檢測了黃尾魚和比目魚魚肉組織中的氯霉素含量[15]。</p><p>　　1.5 免疫分析方法</p><p>　　免疫分析法是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合為基礎(chǔ), 對新型動物性食品中氯霉素和甲砜

35、霉素殘留進(jìn)行定量及半確證方法。</p><p>　　1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)</p><p>　　其最低檢測可達(dá)到0.02 μg/kg左右[16,17],它的優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特異性強(qiáng)。其缺點(diǎn)是因抗體的批次不同檢測結(jié)果存在細(xì)微的差異。</p><p>　　1.5.2 放射免疫測定(RIA)</p><p&

36、gt;　　它是使用以放射性同位素作標(biāo)記的抗原或抗體，用Y射線探測儀或液體閃爍計(jì)數(shù)器測定。Y射線或B射線的放射性強(qiáng)度，來測定抗體或抗原量的技術(shù)。它的優(yōu)點(diǎn)是檢出限為1 μg/kg以上的氯霉素殘留量能進(jìn)行準(zhǔn)確的定量[18-20]。它的缺點(diǎn)是檢測費(fèi)用較昂貴、標(biāo)記物易衰變性和一定的放射性污染。</p><p>　　1.5.3 金標(biāo)試紙條法</p><p>　　它是一種新型的速測技術(shù)，是單克隆技術(shù)和膠

37、體金免疫層析技術(shù)交叉產(chǎn)物。實(shí)例：徐余動等用此法對蝦肉等組織中的氯霉素殘留量進(jìn)行了檢測, 靈敏度最低值可達(dá)到1 ng/mL, 只需5-10 min, 與類似物無交叉反應(yīng)[21]。它的優(yōu)點(diǎn)是簡便易行、快速、試劑安全，特異性強(qiáng)、可單份測定、不需要特殊儀器和設(shè)備、更便于長期保存。多用于先現(xiàn)場檢控[22]。</p><p>　　1.6 其他分析方法</p><p>　　1.6.1 熒光分析法(FIA

38、)</p><p>　　實(shí)例：潘瑩宇等用FIA來測定牛奶中氯霉素的殘留，其加標(biāo)回收率為81%-87%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9 %－8.4 %[23]。</p><p>　　1.6.2 超臨界流體色譜(SFC)</p><p>　　它彌補(bǔ)GC和HPLC的不足，但不可能取代二者。SFC優(yōu)點(diǎn)是可以方便地連接各種靈敏的檢測器(MS，ECD等)。</p><

39、p>　　1.6.3 毛細(xì)管區(qū)域電泳(CZE)</p><p>　　實(shí)例：陳天豹等用CZE法檢測蜂蜜中殘留的抗生素實(shí)驗(yàn)中氯霉素時的檢測極限為10 μg/L [24]。它的優(yōu)點(diǎn)是簡化樣品前處理、多殘留分析以及使分析自動化。其缺點(diǎn)是樣品量太少，限制了檢測的靈敏度。</p><p>　　2 分子印跡固相萃取技術(shù)在檢測樣品前處理的應(yīng)用</p><p>　　2.1 介紹分

40、子印跡和固相萃取</p><p>　　食品檢測中被檢測的物質(zhì)大多是痕量，易受干擾。所以樣品前處理是食品檢測中的關(guān)鍵。</p><p>　　2.1.1 傳統(tǒng)的方法</p><p>　　它包括液液萃取、索式提取、固相萃取等[25]。這里就主要介紹固相萃取。固相萃取(SPE)是由液固萃取與柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。它很好的將分離和濃縮合為一體，通過使用不同選擇性溶劑與洗

41、脫順序來洗脫出雜質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)，達(dá)到分離目的。根據(jù)填料不同可分為以正相吸附、反相吸附和離子交換吸附。傳統(tǒng)的SPE的目標(biāo)物與吸附劑之間的作用力是非特異性的，通常需對萃取和洗脫條件進(jìn)行仔細(xì)選擇，而且對不同基質(zhì)的分離與分析物需要選擇不同的柱填料。</p><p>　　2.2.2 分子印跡固相萃取技術(shù)</p><p>　　它是分子印跡和固相萃取相結(jié)合的產(chǎn)物。它充分利用MIPs獨(dú)特的選擇性和親和力。通

42、過讓模板分子和適合官能團(tuán)的功能單體結(jié)合成分子印跡聚合物，在通過合適的洗脫劑出去模板分子，聚合物中就留下了空穴。這個空穴就只有混合物中待測分離物進(jìn)行可逆性特異性結(jié)合。實(shí)例：Christina等檢測蜂產(chǎn)品中的氯霉素時，用氯霉素為模板分子，甲基丙烯酸作功能單體，用乙二醇二甲基丙烯酸酯作交聯(lián)劑、用偶氮二異丁腈為引發(fā)劑和氯仿為溶劑，于60度熱引發(fā)24小時制得分子印跡聚合物，用該聚合物裝填固相萃取柱對蜂產(chǎn)品中氯霉素進(jìn)行富集，用RP-HPLC定量檢測

43、，該方法對氯霉素的檢測限能達(dá)0.1 μg/ml[26]。</p><p><b>　　3 展望</b></p><p>　　就MISPE的應(yīng)用在氯霉素類抗生素檢測展望主要可以在功能單體與關(guān)聯(lián)劑、聚合方法與印跡方法進(jìn)行探索找出最優(yōu)條件。找出適合氯霉素類抗生素檢測的分子印跡聚合物。尋找合適的上樣溶劑、淋洗溶劑和洗脫溶劑。</p><p><b

44、>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 陳鵬, 羅曉琴. 氯霉素殘留狀況及檢測方法[J]. 動物保健, 2006, 18(10): 41-42</p><p>　　[2] 陳眷華, 彭羽. 氯霉素類抗生素藥物對人類健康的威脅[J]. 貴州畜牧獸醫(yī), 2006, 30(4): 17-18</p><p>　　[3] 李秀萍, 尉新華, 孫

45、艷霞. 淺談氯霉素的危害與控制[J]. 中國動物檢疫, 2003, 20(5): 18</p><p>　　[4] 宋杰, 宋燕青, 王勇鑫, 等. 微生物法在檢測牛奶中氯霉素殘留的應(yīng)用[J]. 河北師范大學(xué)學(xué)報, 2005, 29(1): 85-91</p><p>　　[5] 戴華, 王美玲, 李擁軍, 等. 飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的HPLC測定方法[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室

46、, 2006, 23(6): 1209-1212</p><p>　　[6] Pilar V, Nuria B. Determination of chloramphenicol residues in animal feeds by liquid chloramphenicol in milk[J]. J Assoc Off Anal Chem, 1980, 63(5): 1044-1048</p>

47、<p>　　[7] Jacobson W.C, Allen E.H, Wisemen H.G. Determination of Chloramphenicol in Liver, Kidney, Muscle, and Whole Blood[J]. Presented at 88th Annual Meeting of AOAC, 1974, 20(10): 14-17</p><p>　　[8

48、] 彭莉, 程江, 高嵐, 等. 牛奶中氯霉素殘留的氣相色譜測定法研究[J]. 中國獸藥雜志, 2006, 40(9): 14-17</p><p>　　[9] 宮向紅, 徐英江, 張秀珍. 水產(chǎn)品中氯霉素殘留量氣相色譜檢測方法的探討[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(7): 222-224</p><p>　　[10] 鐘惠英, 楊家鋒, 徐開達(dá). 氣相色譜法定量分析水產(chǎn)品中的氯霉素

49、(CAP)殘留量[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2006, 16(2): 183-185</p><p>　　[11] 洪振濤, 張衛(wèi)鋒, 聶建榮, 等. 氣相色譜法測定動物組織中氯霉素的殘留量[J]. 中國獸藥雜志, 2006, 40(2): 14-16</p><p>　　[12] 周金慧, 張素霞, 沈建忠, 等. 雞組織中氯霉素殘留的氣相色譜-微電子捕獲檢測方法研究[J]. 中國獸藥

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57、ly imprinted polymer for the selective solid-phase extraction of chloramphenicol from honey[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1132(1): 325-328</p><p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計(jì)</b></p><p><

58、b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　基于分子印跡固相萃取技術(shù)的食品中氯霉素類抗生素檢測技術(shù)研究</p><p><b>　　目　錄</b></p><p><b>　　中英文摘要</b></p><p><b>　　1前言13</b>&l

59、t;/p><p>　　1.1食品中氯霉素類抗生素的危害13</p><p>　　1.2樣品的前處理技術(shù)13</p><p>　　1.3分子印跡聚合物的合成方式13</p><p>　　1.4檢測技術(shù)14</p><p>　　2材料和方法14</p><p><b>　　

60、2.1試劑14</b></p><p>　　2.2分子印跡聚合物的制備14</p><p>　　2.3分子印跡聚合物的色譜評價15</p><p>　　2.4分子印跡固相萃取15</p><p>　　2.5樣品制備16</p><p>　　2.6方法驗(yàn)證16</p>&

61、lt;p>　　2.7液相色譜法和質(zhì)譜法16</p><p>　　3結(jié)果與討論17</p><p>　　3.1分子印跡聚合物的制備與評價17</p><p>　　3.2分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化17</p><p>　　3.2.1不同水分含量對色譜保留行為的影響17</p><p>　　3.2.

62、2不同pH值對色譜保留行為的影響18</p><p>　　3.3實(shí)際樣品19</p><p><b>　　4結(jié)論22</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)23</b></p><p>　　附錄錯誤!未定義書

63、簽。</p><p>　　【摘要】以TAP為模板分子、DEAEM為功能單體、EGDMA為交聯(lián)劑、AIBN為引發(fā)劑，用本體聚合法制備分子印跡聚合物，用色譜法對分子印跡聚合物的性能進(jìn)行了評價，并對固相萃取的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，基于該分子印跡聚合物建立的分子印跡固相萃取技術(shù)，結(jié)合LC-MS/MS,，對蝦樣中氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素胺的回收率最高達(dá)98.8℅、98.4℅、98.7℅和97.8℅，極大

64、的提高了氯霉素類抗生素的分離純化速度和檢測靈敏度。</p><p>　　【關(guān)鍵詞】分子印跡聚合物；固相萃取；LC-MS/MS </p><p>　　【ABSTRACT】The molecularly imprinted polymers (MIPs) were prepared using TAP as the mimic template molecule, DEAEM as the f

65、unctional monomer, EGDMA as the cross-linker and AIBN as and the initiator by bulk polymerization. The characteristics of the MIPs were evaluated by liquid chromatographic analysis. Further, the conditions of molecularly

66、 imprinted solid phse extraction (MISPE) based on the MIPs were optimized. The MISPE was shown to be applicable for clean-up and enrichment of CAP, FF, TAP an</p><p>　　【KEYWORDS】 MIPs；Solid phase extraction；

67、LC-MS/MS </p><p><b>　　前言</b></p><p>　　食品中氯霉素類抗生素的危害</p><p>　　氯霉素類抗生素的成員有氯霉素（Chloramphenicol）、甲砜霉素（Thiamphenicol）和氟甲砜霉素（Florfenicol）。氯霉素（CAP）是一種由委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomyces vene

68、zuela)中分離提取的廣譜抗生素。它能較強(qiáng)的抑制多種病原菌，所以氯霉素曾被廣泛的應(yīng)用在養(yǎng)殖業(yè)中，但經(jīng)過大量的研究與臨床應(yīng)用人們發(fā)現(xiàn)：氯霉素對人體和動物體的肝細(xì)胞、骨髓細(xì)胞有一定的毒副作用，它可以引起可逆性的骨髓抑制、不可逆的再生障礙性貧血和嚴(yán)重的胃腸道反應(yīng)、外周神經(jīng)炎、二重感染、灰嬰綜合癥，而且在對肉雞和小白鼠的臨床研究中發(fā)現(xiàn)他會引起其免疫抑制反應(yīng)和遺傳毒性[1-3]。氯霉素的殘留問題引起了國家的高度重視。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定在可食用動物的

69、可食部分不得檢出氯霉素，且氯霉素也了動物性食品日常檢測的必檢項(xiàng)目之一。2002年3月15日，被我國農(nóng)業(yè)部關(guān)于發(fā)布《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》列為禁止使用的抗生素。因?yàn)槁让顾鼐薮蟮亩靖弊饔?，人們開發(fā)了兩種氯霉素的代替物，即甲砜霉素（TAP）和氟甲砜霉素(FF)。TAP和FF克服了CAP導(dǎo)致的再生障礙性貧血的缺點(diǎn)[4]。FF因其成本較高而</p><p><b>　　樣品的前處理技術(shù)</b&g

70、t;</p><p>　　在實(shí)際樣本檢測時由于檢測樣多且復(fù)雜，含有多種干擾物質(zhì)，對檢測樣的前處理就顯得至關(guān)重要了?，F(xiàn)有的樣品的前處理的方法主要有液液萃取和固相萃取。這兩種方法的回收率分別主要取決于實(shí)驗(yàn)員對液液萃取技術(shù)掌握的熟練程度和分析物的官能團(tuán)和吸附劑之間的相互作用[5]。所以SPE較LLE有這更高的靈敏度，能更好的對樣品進(jìn)行富集。而SPE的靈敏度高低則與吸附劑的好壞有這密切的關(guān)系。分子印跡聚合物因具備與模板分

71、子相配套大的結(jié)合位點(diǎn)和空穴而具有對模板分子的專一的識別能力，能進(jìn)一步的提高固相萃取的對樣品的富集效果[6]。說以本次實(shí)驗(yàn)使用的預(yù)處理技術(shù)是分子印跡固相萃取技術(shù)。 </p><p>　　分子印跡聚合物的合成方式</p><p>　　分子印跡聚合物的合成方法主要是共價印跡方法、非共價印跡法和半共價法[7]。共價印跡方法也可以叫做預(yù)組裝合成法。它的流程是這樣的：先把功能單體和模板分子反應(yīng)合成

72、模板復(fù)合功能單體，再在合適條件下反應(yīng)生成聚合物，把聚合物研磨至粉末狀，用適當(dāng)?shù)娜軇┏ツ０宸肿樱罱K制得所需的分子印跡聚合物。該方法中模板分子和功能單體間的作用力主要是共價鍵。其合成聚合物的優(yōu)點(diǎn)是立體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，萃取特異性比其他制備法要高。缺點(diǎn)是要制備模板復(fù)合功能單體，有些模板分子是找不到合適的方法合成該模板復(fù)合功能單體的。目前很少在固相萃取中使用。</p><p>　　非共價印跡法也可叫做自組裝方法，該流程為：按

73、照一定比例混合模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑，模板分子通過非共價作用力與功能單體和交聯(lián)劑發(fā)生作用合成分子自組裝體，后面的流程大致與第一種方法相同。因?yàn)樵摲椒ㄊ侵苯訉⒏鞒煞种苯踊旌暇酆系?，所以該方法適用范圍廣、模板分子較易除去。因非共價的分子間作用力較弱，在聚合反應(yīng)時往往都是加過量的功能單體，這就嚴(yán)重影響了萃取時的非特異性吸附，降低了萃取的選擇性。</p><p>　　該方法有時會出現(xiàn)“模板滲漏”的現(xiàn)象，即用溶

74、劑處理合成的聚合物顆粒時，很難把其中的模板分子完全洗凈，當(dāng)用該分子模板聚合物萃取范圍為pg-ng/mL的樣品時，會造成嚴(yán)重的誤差。解決此問題的方法的方法是采用替代模板聚合法，即用分析物的類似物替代分析物做模板制備分子印記聚合物，最后再用色譜法把分析物和它的類似物分開。這樣就能避免“模板滲漏”的干擾。</p><p>　　半共價法的流程是：模板分子共價結(jié)合功能單體，再加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑進(jìn)行聚合反應(yīng)，通過破壞共價鍵來

75、洗脫待測物分子[8]。該方法在萃取時，分子印記聚合物和待測物之間僅僅依靠非共價相互作用結(jié)合。此方法的優(yōu)點(diǎn)是；聚合物結(jié)構(gòu)更加完整、結(jié)合位點(diǎn)的均一性更好、萃取能力更強(qiáng)和萃取容量更大。能從根本上解決“模板滲漏”的影響。</p><p><b>　　檢測技術(shù)</b></p><p>　　近幾年，國內(nèi)外的研究者提出了很多食品中氯霉素類抗生素殘留的的檢測技術(shù)。如微生物學(xué)法[9]、

76、免疫分析法[10-15]、氣相色譜法（GC）[16]、高效液相色譜法（HPLC）[17]、色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法[18]等。其中色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法中的LC-MS/MS法最好，它有這高的靈敏度，能夠滿足痕量氯霉素類抗生素的定性和定量分析，但是該方法并易普及，因?yàn)樵摲椒ǖ倪M(jìn)本品的純度有很高的要求，即前處理的要求很高，并且儀器價格很昂貴。微生物法的優(yōu)點(diǎn)為簡單經(jīng)濟(jì)，缺點(diǎn)為操作耗時、缺乏特異性和靈敏度不高。酶聯(lián)免疫法的優(yōu)點(diǎn)在于高靈敏度、高特異性、樣品預(yù)處

77、理簡單、成本低和無需復(fù)雜的儀器設(shè)備， 缺點(diǎn)是假陽性、不能進(jìn)行定性，一般要用色譜方法來進(jìn)行確定。放射免疫法的（RIA）的優(yōu)點(diǎn)在于高靈敏度、強(qiáng)特異性、低檢測限量和操作簡單等，缺點(diǎn)是發(fā)射性物質(zhì)量較大、耗材貴、同位素半衰期短等。氣相色譜法不足之處在于前處理過程復(fù)雜、分析慢、儀器化程度高、譜圖中干擾峰多等。單純的液相色譜已經(jīng)不能滿足現(xiàn)今世界氯霉素低檢測限的要求。還有一些新興的檢測技術(shù)，如超流體色譜（SFC）、毛細(xì)管區(qū)域電泳（CZE）[19]等。S

78、FC的優(yōu)點(diǎn)在于能方便地連接各種</p><p><b>　　材料和方法</b></p><p><b>　　試劑</b></p><p>　　模板分子甲砜霉素（TAP）和交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）是購自Flnka公司(Steinheim, USA)。氟甲砜霉素（FF）和氯霉素（CAP）都是從Sigma-Ald

79、rich公司(Steinheim, Germany)購買的。功能單體甲基丙烯酸二乙胺基乙酯(DEAEM)是購自Sigma-Aldrich公司。引發(fā)劑2,2'-偶氮二異丁腈（AIBN）是從中國醫(yī)藥集團(tuán)總公司（上海，中國）購買的。HPLC級的乙腈和甲醇都是購自美國的飛世爾科技公司。所有其它試劑均為分析純。雙蒸水和超純水都是由本地的供應(yīng)商提供的。</p><p>　　分子印跡聚合物的制備</p>

80、<p>　　聚合物是由相似物模板分子TAP和功能單體DEAEM制備。分子印跡聚合物的制備工作如下：簡要的說，1 mmol模板TAP和相應(yīng)數(shù)量功能單體DEAEM（表2）溶解于5.0 mL的乙腈中。溶解后再加入25mmol交聯(lián)劑EGDMA和引發(fā)劑AIBN(1% w/w, 總單體)，然后這個混合物用氮?dú)馇逑? min和超聲波震蕩10min。最后，70℃水浴中用氮?dú)夥夤芄庹?4h,制的的聚合物進(jìn)行研磨和篩選，用丙酮沉降除去殘留的細(xì)微顆

81、粒，收集直徑25-50μm的顆粒，然后將這些粉末置于索式提取器上，后用甲醇：甲酸(9:1, v/v)不斷提取，直到用HPLC-UV分析時沒有發(fā)現(xiàn)TAP為止，然后將聚合物裝進(jìn)10.0mL的固相萃取柱中。然后用甲醇去除去殘留的甲酸，再在50℃真空中干燥8h?？瞻拙酆衔锏暮铣沙患幽０宸肿油?，其余方法同上。</p><p>　　分子印跡聚合物的色譜評價</p><p>　　分子印跡聚合物性能的測

82、試方法主要有3種，即電勢測定法、高效液相色譜分析和傅氏變換紅外光譜法和核磁共振法。電勢測定法是運(yùn)用流動電位的原理，通過記錄用印跡分子溶液洗滌過的裝有印跡聚合物的流通池的兩端的電位變化來評價分子印跡聚合物對其印跡分子的選擇性的好壞。傅氏變換紅外光譜法和核磁共振法因洗脫印跡分子后印跡聚合物內(nèi)留有與印跡分子相互作用的結(jié)構(gòu)單元而在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用的不多。高效液相色譜分析則是最常用的檢測技術(shù)。它是通過最后顯示的圖像來確定MIPS對印跡分子是否具有選

83、擇性以及選擇性的大小。本次實(shí)驗(yàn)用的是高效液相色譜分析。高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)是由LC-6A泵、紫外檢測器、20μL進(jìn)樣器和色譜柱等組成。色譜評價要看的數(shù)據(jù)分別是保留因子（k）、印跡因子（IF）、保留指數(shù)（RI）和選擇性因子（α）。保留因子的計(jì)算公式為(t-t0)/t0，其中t是分析物在色譜柱上的保留時間，to是死時間即分析物在空白色譜柱上的保留時間。印跡因子是通過kMIP與kNIP的比來衡量的，其中kMIP是分析物在MIPs色譜柱

84、上的保留因子，kNIP是分析物在NIPs色譜柱上的保留因子；保留指數(shù)是通過αNIP與αMIP的比來</p><p><b>　　分子印跡固相萃取</b></p><p>　　分子印跡固相萃取的第一種操作方式為通過使用MIPs從萃取非極性有機(jī)溶劑那里萃取分析物。MIPs的分子識別能力和吸附萃取時的溶劑有很大的關(guān)系。只有在固相萃取的上樣液與合成聚合物時的溶劑相同時，它的分

85、子識別能力選擇性最強(qiáng)。對于水基樣品的萃取，人們采用一下的方法萃?。合扔梅菢O性有機(jī)溶劑從水樣中萃取分析物，此次萃取過程中主要是因疏水性作用的不同來進(jìn)行萃取的。所以在這些有機(jī)溶劑中還含有許多其他的干擾物，再把這些有機(jī)萃取液通過分子印記聚合物柱，這樣就能分別洗脫出干擾物和分析物來以便后來的檢測。</p><p>　　第二種操作方式是直接用分子印跡聚合物萃取水樣．此時分析物和其它干擾物質(zhì)都發(fā)生了吸附萃取。在該步中，萃取的

86、主要作用力是疏水性作用，因此該步是沒有選擇性。為了提高選擇性，就要在第一步的萃取后，用合適溶劑對分子印跡聚合物柱進(jìn)行洗脫，洗脫目的是除去由疏水性作用造成的干擾，在洗脫中，目標(biāo)分析物因與分子印跡聚合物之間的特異性親合力保留在聚合物柱上 ，然后再合適溶劑把分析物洗脫下來。 該方法比較適合大體積水樣的萃取檢測</p><p>　　第三種操作方式是分子印跡固相萃取脈沖洗脫分析物。用合適的流動相上樣過柱，在通過質(zhì)子極性溶劑

87、產(chǎn)生的快遞的脈沖式洗滌洗脫分析物。在線微分脈沖洗脫方式是這樣進(jìn)行的：先采用非質(zhì)子性極性溶劑以脈沖方式洗脫干凈非選擇性吸附的干擾物質(zhì)，再用質(zhì)子性極性溶劑以脈沖方式洗脫分析物以用于檢測。</p><p>　　將懸浮在乙腈中的25mg的MIPs和NIPs分別加入到1.0mL的固相萃取柱中。再萃取前，萃取柱先后用10mL甲醇-甲酸(9:1, v/v)，5mL甲醇洗滌和用5mL的上樣溶劑預(yù)處理。</p>&l

88、t;p>　　含有X µg/ml CAP,FF和TAP的1.0mL的水加入到萃取柱中。在色譜分析評估的基礎(chǔ)上對淋洗和洗脫步驟的條件進(jìn)行優(yōu)化。淋洗液是1×3 mL 含10% 乙腈的 PBS 緩沖液 (pH=4, 濃度)，洗脫步驟用3mL的甲醇-甲酸(9:1, v/v)在低于0.5 mL/min流速下洗脫，洗脫液要在40 °C下用氮?dú)獯蹈?，其殘留物要再溶?.0mL的色譜分析的流動相中。</p>

89、<p><b>　　樣品制備</b></p><p>　　蝦樣是從當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I的并用LC-ESI-MS/MS法確認(rèn)不含有可檢測出的CAP、 FF、TAP 和FFA。稱5.0 g的攪碎的蝦樣于50 mL的離心管中 ，加內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液CAP-d5到濃度1.0 μg/kg。</p><p>　　樣品在渦旋振蕩器上振蕩30s，再靜止2h，再向蝦樣中加入20mL乙腈，

90、渦旋振蕩2min，超聲波振蕩15min，再在離心力為5.0 × 103 g離心10min。上清液轉(zhuǎn)移到100mL的梨形瓶中，沉淀物再用10mL乙腈重復(fù)一次，上清液吸取合并在-20 °C冰凍保存2h，在離心力5.0 × 103 g下離心10min。上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃真空下蒸干，殘留物在懸浮于5mL的10%甲醇—水中。對分子印記固相萃取柱相繼用10mL甲醇-甲酸液（90/10，v/v）和5mL甲醇活化，

91、再用2mL水、3mL乙腈-水（10:90，v/v）淋洗分子印記固相萃取小柱，真空處理10min以去除殘留溶劑，再用1mL己烷淋洗小柱，同樣真空處理10min以去除殘留溶劑，純化的萃取物用3mL甲醇洗脫出來，洗脫物在40℃下用氮?dú)庹舾梢员鉒C-MS/MS分析。</p><p><b>　　方法驗(yàn)證</b></p><p>　　該方法通過以下參數(shù)驗(yàn)證：線性關(guān)系和線性范圍、

92、精確度、特異性、靈敏性、日內(nèi)檢測精度和日間檢測精度、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）[20]。CAP的校準(zhǔn)曲線是用CAP濃度（0.15、0.3、0.45、1.0、2.0μg/kg）與相應(yīng)濃度的分析物內(nèi)標(biāo)峰面積的比構(gòu)建的。TAP、FF和FFA的校準(zhǔn)曲線是分別用TAP、FF和FFA濃度（1.5、3.0、4.5、10、20μg/kg）與相應(yīng)濃度的分析物內(nèi)標(biāo)峰面積的比構(gòu)建的，該方法的日內(nèi)檢測精度和日間檢測精度用同天內(nèi)的五個重復(fù)和連續(xù)五天的重復(fù)

93、來計(jì)算。這方法的準(zhǔn)確度和精確度是分別通過在三份分析中三個標(biāo)準(zhǔn)水平(0.15、0.3、0.45μg/kg CAP，1.5、3.0、4.5μg/kg TAP、FF和FFA)下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來決定的。檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別是由信噪比3和10決定的。</p><p><b>　　液相色譜法和質(zhì)譜法</b></p><p>　　超高性能的LC-MS/MS

94、系統(tǒng)由配備XEVO四級桿質(zhì)譜儀的高效液相色譜系統(tǒng)構(gòu)成。進(jìn)樣體積是5 μl而且色譜分析分別是用MIPs色譜圓柱和NIPs色譜圓柱(100 mm×2.1 mm 內(nèi)直徑, 1.7 μm 顆粒大小)在40℃下進(jìn)行。質(zhì)譜儀是分別是在毛細(xì)管電壓3.5 kV 和 3.3 kV下的陽性和陰性噴霧模式下進(jìn)行。離子源和脫溶劑化的溫度分別是125 °C 和450 °C。脫溶劑的氣體是氮?dú)?，碰撞誘導(dǎo)解離氣體是氬氣。氣體的脫溶和霧化

95、是分別在流速為800和50 L/h的氮?dú)庀逻M(jìn)行的。在碰撞室，氬氣在3.0×10-3 mbar壓力下被用做碰撞氣體。信號的捕捉是用多離子反應(yīng)監(jiān)測來進(jìn)行的。每個樣品要加入兩次分別在陽性和陰性離子化下進(jìn)行分析。其它的參數(shù)如表1所示。</p><p>　　表1 目標(biāo)化合物UPLC-MS/MS的參數(shù)</p><p>　　流動相A2：乙腈-水(5:95, v/v)含0.3 % (v/v)氨氣

96、，B2：乙腈含0.3 % (v/v)氨氣</p><p><b>　　結(jié)果與討論 </b></p><p>　　分子印跡聚合物的制備與評價</p><p>　　圖1 CAP、FF和TAP的化學(xué)結(jié)構(gòu)式</p><p>　　表2 合成分子印跡聚合物的性能評估（印跡因子IF） </p><p>　　T

97、AP持有兩個相同的游離羥基，這些羥基和化學(xué)結(jié)構(gòu)對分子與分子印跡聚合物中的結(jié)合腔的特異性相互作用是至關(guān)重要的。TAP和FF的結(jié)構(gòu)類似于CAP，唯一的不同在于TAP的–SO2CH3取替了–NO2，F(xiàn)F的–F取替了–OH，而且–SO2CH3有這比–NO2更大的空間結(jié)構(gòu)。所以，本實(shí)驗(yàn)為了克服這些不足是用TAP作為模板用本體聚合的方法合成分子印跡聚合物的。對制備的分子印跡聚合物的初步評估是以乙腈為流動相的色譜分析來進(jìn)行研究的。查閱文獻(xiàn)得知功能單體

98、與模板TAP的最佳比為1：3時，印跡聚合物對TAP、FF和CAP的最高的印跡效應(yīng)，其印跡因子正如表2所示，從表看出本實(shí)驗(yàn)制的的聚合物對TAP和FF有這相似的印跡效果和識別選擇性。這就說明了TAP和FF在結(jié)構(gòu)上還是很相似的，而CAP的IF值和TAP有這一定的距離。這就能很好的解決有CAP模板制備分子印跡聚合物時存在的“模板滲漏”問題。在1997年Levi等制備的CAP分子印跡聚合物的研究中的功能單體和CAP的最佳摩爾比是2：1，而在200

99、7年shi等人的研究中發(fā)現(xiàn)最佳摩爾比為4:1。這原因可能在于模板分子CAP和TAP結(jié)構(gòu)的不同和功能單體在水中的溶解度不</p><p>　　分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化</p><p>　　不同水分含量對色譜保留行為的影響</p><p>　　圖2 在不同乙腈比例的流動相下分子印記聚合物對CAP、FF和TAP的色譜保留行為</p><p>　　

100、正如圖2所示，當(dāng)使用乙腈作為流動相時，空間相互作用、氫鍵和離子間的相互作用是主要的特異性結(jié)合力，此時CAP、FF和TAP的保留系數(shù)分別為3.61、1.35和2.70，很明顯此時CAP的保留系數(shù)是最高的。而且隨著流動相中水的比例的逐漸增加，CAP、FF和TAP的保留系數(shù)也增加。當(dāng)用30%的乙腈流動相時，CAP、FF和TAP的保留系數(shù)分別為3.91、2.91和0.57，最低保留系數(shù)是TAP的0.57。結(jié)果表明分析物和分子印跡聚合物之間的氫鍵

101、被破壞和空間結(jié)構(gòu)和離子間的交互作用是分析物與分子印跡聚合物識別的關(guān)鍵因素。特別是低于20%乙腈流動相時，CAP、FF和TAP都沒有觀察到明顯的頂峰，這說明了分子印跡聚合物對CAP、FF和TAP是完全吸收。</p><p>　　不同pH值對色譜保留行為的影響</p><p>　　為了進(jìn)一步優(yōu)化分子印跡固相萃取，流動相的pH值也要進(jìn)行篩選。如圖3所示：分子印跡聚合物中TAP和FF的保留系數(shù)在p

102、H值為2.0到8.0之間時只發(fā)生了細(xì)微的改變。同時發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動相pH值為8.0時，CAP的保留系數(shù)與酸性條件下相比有這大幅度的下降，還有就是在酸性條件下分子印記聚合物對CAP、FF和TAP有較高的親和力，因此加樣溶劑和淋洗溶劑的pH值最好是適當(dāng)?shù)乃嵝?。這些都說明了在水溶劑中空間結(jié)構(gòu)和離子間的相互作用是分析物與分子印跡聚合物之間的關(guān)鍵的相互作用。</p><p>　　圖3 不同PH流動相下分子印跡聚合物對CAP、FF

103、和TAP的色譜保留行為。1-CAP 2-FF 3-TAP</p><p>　　為了檢驗(yàn)分子印跡固相萃取的優(yōu)化條件的有效性和分子印跡聚合物的選擇性，挑選了四種類似物，分別是CAP、TAP、FF和FFA。其標(biāo)準(zhǔn)溶液都是20 μg mL-1。在淋洗步驟中，用3×1 mL10%乙腈—水（pH=5）去除沒有與分子印跡聚合物特異性結(jié)合的物質(zhì)。洗脫劑采用3 mL甲醇，正如圖4所示：在分子印跡聚合物萃取柱中CAP、TA

104、P、FF和FFA的回收率分別是82.6%、87.6%、77.9%和82.3%，而非分子印跡聚合物萃取柱中它們的回收率為23.2%、28.9%、39.6% 和 34.5%。CAP、TAP、FF和FFA對分子印跡聚合物的特異性親和力分別是59.4%、58.6%、38.3% 和 47.8%。結(jié)果表明分子印跡聚合物展現(xiàn)了強(qiáng)的特異性親和力。在上樣過程中，CAP、TAP、FF和FFA被完全的吸附在了分子印跡聚合物中。結(jié)果表明制備的分子印跡聚合物對C

105、AP、TAP、FF和FFA的選擇性是很強(qiáng)的。鑒于CAP、FF、TAP和FFA持有相似的結(jié)構(gòu)骨架和不同的側(cè)鏈，制備的分子印跡聚合物萃取柱呈現(xiàn)了對CAP、FF、TAP和FFA相似的回收率和不同的特異性親和力。這也說明了目標(biāo)分子和印跡結(jié)合</p><p>　　圖4 CAP、FF、TAP和FFA在MISPE和NISPE柱上的回收率</p><p><b>　　實(shí)際樣品</b>

106、;</p><p><b>　　標(biāo)準(zhǔn)曲線</b></p><p>　　圖5 CAP的標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　在本方法確定的色譜條件下，CAP的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示。線性回歸方程為y=4962.6x+275.22，R2=0.9984。因R2小于1，所以CAP在0.15-2.0 μg/kg內(nèi)間峰面積（y）和進(jìn)樣濃度（x）呈一定的線性關(guān)系。<

107、;/p><p>　　圖6 TAP、FF和FFA的標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　在同樣色譜條件下，TAP、FF和FFA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示。TAP、FF和FFA在1.5-20μg/kg內(nèi)間峰面積（y）和進(jìn)樣濃度（x）呈一定的線性關(guān)系。TAP線性回歸方程為y=636.2x+10.317，R2=0.997；FF線性回歸方程為y=541.52x+23.238，R2=0.9988；FFA線性回歸方程為y