血樣dna的提取

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)高質(zhì)量血樣DNA的提取，理解DNA提取操作原理，在提取過程中學(xué)習(xí)離心機(jī)、Vortex等的使用,實(shí)驗(yàn)原理,應(yīng)用物理、化學(xué)等方法從病人血樣中提取較純的全基因組DNA,靜置后的血液,,血液主要成分,,紅細(xì)胞,白細(xì)胞,血小板,,,,,,,,,血漿蛋白,水,其他物質(zhì),,,,無機(jī)鹽、葡萄糖、氨基酸,,血細(xì)胞種類,最多,最少,1．成熟紅細(xì)胞無核，兩面凹的圓餅狀。,功能,2．含血紅蛋白，紅色。,1．體積比紅細(xì) 胞大。,2．有核

2、，種類 繁多。,1．體積最小， 無核。,血細(xì)胞特征比較,,適中,,,促進(jìn)止血，加速凝血,防御保護(hù),運(yùn)輸氧氣和部分二氧化碳,血漿主要成分,,結(jié)論,血樣各種成分中，只有白細(xì)胞含有DNA。,物理方法,離心機(jī)（型號(hào)：S×4250） : 沉淀,Vortex-5：混勻,化學(xué)試劑,溶血液: 9ml 作用：溶解紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板白細(xì)胞核懸浮液：2ml 作用：使白細(xì)胞核充分懸?。☉腋≈饕?/p>

3、物理方 法：vortex）白細(xì)胞核裂解液：2ml 作用：裂解白細(xì)胞核，使DNA釋放,,化學(xué)試劑,蛋白沉淀液：1.33ml 作用：使Pr變性沉淀異丙醇：4ml 作用：洗滌并沉淀DNA70%乙醇：3ml 作用：洗去較難揮發(fā)的異丙醇、鹽離 子等,,實(shí)驗(yàn)操作,血樣→ 加溶血液 → 離心 → 加核懸浮液→ 加核裂解液（立即震蕩可過夜）→ 加蛋白沉淀液（立即震蕩20s) → 離心→

4、 留上清，加入異丙醇→ 離心→ 留沉淀，加70%乙醇→ 加TE→ 測OD,實(shí)驗(yàn)操作,步驟一：,血樣,,溶血液,細(xì)胞碎片、白細(xì)胞核,溶血液：( NH4Cl：155mM , NaHCO3 ：10mM , EDTANa2：1.0mM ),注意事項(xiàng),能否提到高質(zhì)量的DNA，好的血樣是首要前提，故采集的血樣應(yīng)置于冰箱保存，并盡早進(jìn)行DNA提??；做好標(biāo)記：15ml離心管、1.5ml EP管均需首先進(jìn)行標(biāo)

5、號(hào)；移液管使用前必須消毒，減少污染；移液管頂部要塞上棉花，防止反應(yīng)液吸入 移液槍內(nèi)；,,注意事項(xiàng),從冰箱中取出血樣時(shí)，要小心、不宜晃動(dòng)，否則容易導(dǎo)致棄去血漿時(shí)，損失白細(xì)胞；補(bǔ)加溶血液時(shí)，應(yīng)加至離心管12ml，即加入的溶血液體積應(yīng)是原血樣的3倍左右； 溶血5min后，在燈下看管內(nèi)有無血塊→If 有，可進(jìn)行二次溶血；,實(shí)驗(yàn)操作,離心機(jī)：4000 rpm 5min 4℃ ，使白細(xì)胞核

6、 沉淀，棄去細(xì)胞碎片等大部分雜質(zhì),,步驟二：,細(xì)胞碎片、白細(xì)胞核,,離心,沉淀：白細(xì)胞核、少量雜質(zhì)（血紅素、RNA、蛋白）,注意事項(xiàng),離心前注意配平，一則保護(hù)離心機(jī)，二則使離心效果更佳→ If 沉淀不緊密，可置于冰上5min,再離心一次。離心后，沉淀是白細(xì)胞核團(tuán)， 離心管倒扣于吸水紙的時(shí)間不宜太長，也不宜反復(fù)倒殘余液，否則易導(dǎo)致白細(xì)胞核團(tuán)損失。,血紅素,,注：血紅素可通過其卟啉環(huán)與Taq酶的不可逆

7、 結(jié)合而抑制 Taq酶活性，對(duì)DNA的后續(xù) 應(yīng)用造成影響，必須盡量除盡,血紅素的除去,血紅素溶于水，所以可以在洗滌過程中被除去，當(dāng)離心后的細(xì)胞核基本不帶紅色，說明血紅素基本已除盡,RNA,由于RNA基本上存在于細(xì)胞質(zhì)中，因而細(xì)胞膜破裂后，存在于上層液體中，離心后大多數(shù)已經(jīng)除去。,,實(shí)驗(yàn)操作,步驟三：,,沉淀：（白細(xì)胞核、少量雜質(zhì)）,,細(xì)胞核懸浮于溶液中,白細(xì)胞核懸浮液,懸浮液：( Tris-HCl：50mM、PH=8

8、.0 , NaCl：150mM （=生理鹽水：0.9%?）, EDTANa2：20mM ) 白細(xì)胞核的懸浮主要是vortex的功勞，因而要立即并充分 vortex,實(shí)驗(yàn)操作,步驟四：,,細(xì)胞核懸浮液,,細(xì)胞核裂解液,DNA、大量蛋白、RNA、鹽類微量血紅素,核裂解液： ( Tris-HCl , NaCl , EDTANa2（以上各溶度

9、 同步驟三） ,SDS：2%),實(shí)驗(yàn)操作,步驟五：,DNA、大量蛋白、其他雜質(zhì),,蛋白沉淀液,溶解狀態(tài)的DNA、絮狀蛋白沉淀、RNA沉淀,,離心，取上清,DNA、鹽類、微量RNA 、蛋白,蛋白沉淀液：（CH3COONH4 ：7.5M） 離心：4500rpm 15min 4℃,注意事項(xiàng),細(xì)胞核的裂解是關(guān)鍵，因此必須保證充分的裂解時(shí)間，可過夜，至少一小時(shí)。加入白細(xì)胞核裂解液和蛋白沉淀

10、液時(shí)，均應(yīng)立即Vortex,使反應(yīng)充分。Vortex：5檔位置，20s ， 使白細(xì)胞核裂解液或蛋白沉淀液與樣品充分混勻并反應(yīng)。,實(shí)驗(yàn)操作,步驟六：洗滌DNA,,上清液,,絮狀DNA、微量RNA、異丙醇、鹽,異丙醇，離心，取沉淀,,絮狀DNA、乙醇,70%乙醇，離心，取沉淀,注意事項(xiàng),離心機(jī)：4500 rad/min 10min 4℃ ，使洗滌后的DNA沉淀，從而洗去大部分鹽離子 加入的異丙醇的量一般為DNA溶液體積的0.

11、6-1倍加異丙醇和乙醇時(shí)，混勻方式應(yīng)柔和，否則易導(dǎo)致DNA斷裂，故不宜使用 vortex。倒完乙醇后，為使離心管內(nèi)的殘余液盡量倒干，可將其倒扣在吸水紙上，從而減少乙醇揮發(fā)時(shí)間。,實(shí)驗(yàn)操作,步驟七：1×TE貯存 → OD值檢測（測濃度）、電泳檢測（測完整性） 1: 1*TE :（Tris-HCl：10mM、PH=8.0 ,

12、 EDTANa2：5mM ） 2: OD值檢測: A260/280: > 1.8 RNA污染； = 1.8 DNA提純效果好； （一般在1.8-2.0，即滿足

13、條件） < 1.8 Pr污染。 A260/230: ≥2.0 DNA提純效果較好； < 2.0 存在鹽離子、多肽、碳水化合物等污染。

14、 電泳檢測：0.8%的瓊脂糖、20ng DNA ( 對(duì)照：廢血DNA）,,,,,,實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng),若同時(shí)檢測多個(gè)所提DNA的OD值時(shí)， 由于操作時(shí)間長，微量樣品易揮發(fā)，故 宜在冰上操作。,OD值結(jié)果,,,,,,,,,,編號(hào),3621,3619,3620,DNA含量（ng/ul),260/230,260/280,3622,1.90,1.90,1.89,2.08,2.1

15、8,2.02,2.13,2.19,1.90,3623,1.89,146.57,246.06,121.08,212.64,316.29,從以上數(shù)據(jù)可知：A260/280在1.8-2.0之間，A260/230均>2.0。說明所提DNA較純，符合要求。,電泳檢測結(jié)果,檢測結(jié)果顯示：五個(gè)樣品的條帶基本處于同一位置，且都位于10kb 的上方 ＝> 所提取的DNA 完整性較好。,討論,1、DNA儲(chǔ)存條件：短期（2-3天）→ 4

16、℃； 長期（兩周以上） → -80 ℃2、血樣-80度長久保存（如：1年以上）， 細(xì)胞較難裂解，應(yīng)如何處理？ 答：提前一晚放到4度即可；為了速融，可置于37度水浴一 會(huì) 。3、跑電泳后主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌 散，亮度比較均衡地衰減，說明DNA 出現(xiàn)降

17、 解，原因？解決方案？ 答：1，勻漿操作不對(duì)； 2，樣品不新鮮和冷凍保存不好,實(shí)驗(yàn)總結(jié),通過上網(wǎng)查詢實(shí)驗(yàn)原理以及董潔老師、楊帆、楊曦師兄、藝馨、李揚(yáng)師姐等的指導(dǎo)，對(duì)如何從血樣中提取高質(zhì)量的全基因組DNA有了一個(gè)較清楚的認(rèn)識(shí)。,,下一步實(shí)驗(yàn)計(jì)劃,為了進(jìn)一步加深對(duì)原理的理解，以及提高提DNA的實(shí)驗(yàn)操作技能，計(jì)劃在董潔老師的指導(dǎo)下，獨(dú)立完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作,并且針對(duì)前幾次操作過程中不規(guī)