dna序列測定課件

1、第八章 DNA序列測定,王 文 君,廣州中醫(yī)藥大學分子生物學技術實驗室免疫研究室,自然界中物種(生物)的豐富多樣性是由其生命本質決定的，物種的本質特征的多樣性首先體現(xiàn)在其DNA序列的多樣性(病毒為RNA)，這種千差萬別的DNA序列正是自然界中形態(tài)和功能各異的物種的基石。我們要了解各物種的本質特征，就必需從其DNA的一級結構上開始。因為其DNA的一級結構是各物種生理功能的基礎，也是我們對其進行深入研究的出發(fā)點。,DNA是物種生存和發(fā)展

2、的基石,一、物種的生存 DNA→RNA→多肽,,二、物種的繁衍,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,DNA,,,,,,,測 序 方 法DNA序列測定是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的基礎上建立起來的?？煞蛛x相差僅1個堿基的300～500bp的核酸分子。一.雙脫氧末端終止法二.化學裂解法三.基因芯片法,1977年，Sanger在加減法基礎上提出了雙脫氧末端終止法測序，其原理如下： 四個反應

3、管中，在DNA聚合酶催化下，以單鏈DNA為模板，加入單引物、四種dNTP，以及每管中加入雙脫氧核糖核苷酸ddA、ddT、ddG、ddC。雙脫氧核苷酸(ddNTP)的5’端-OH是正常的，而其3’端-OH則沒有，因此能與引物延伸鏈的3’端連接，而不能連接其后繼核苷酸，于是引物鏈的延伸至此結束，經(jīng)過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，根據(jù)電泳圖譜即可拼出所測DNA序列（即DNA的核苷酸順序）。,,,,,A反應,G反應,T反應,C反應,DNA聚合酶M

4、g離子DNA模板引物 dNTPsddATP,DNA聚合酶Mg離子DNA模板引物 dNTPsddGTP,DNA聚合酶Mg離子DNA模板引物 dNTPsddTTP,DNA聚合酶Mg離子DNA模板引物 dNTPsddCTP,,,,,,O,,堿基G、C、A、T,,C,,O,,HPO,,OH,脫氧核糖核苷酸(dNTP)的分子結構式,1’,2’,3’,4’,5’,P,,,,,,,,,,O,堿基G、C、A、T,C

5、,,HPO—,雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)的分子結構式,1’,2’,3’,4’,5’,O,核苷酸鏈示意圖,末端終止法圖解,正常,雙脫氧ddNTP,3`—ATTGCGATCTAGTGGCTAATG—5`,CGCTAGATCACCGATTAC,5`—TAA,3`—ATTGCGATCTAGTGGCTAATG—5`,5`—TAA,CGCTA,5`—TAA,CGCTAG,5`—TAA,5`—TAA,5`—TAA,5`—TAA,CGCTAGA,

6、CGCTAGAT,CGCTAGATC,CGCTAGATCA,5`—TAA,5`—TAA,CGCTAGATCAC,CGCTAGATCACC,末端終止法測序步驟,一.測序DNA模板制備二.四種反應液的準備三.引物與模板退火四.延伸反應五.電泳六.讀序,DNA測序方法,末端終止法：最常用?；瘜W裂解法：研究DNA的二級結構，與蛋白質的相互作用。雜交測序法：DNA多態(tài)性分析。,一. 測序模板的制備,測序可分為單鏈測序與雙鏈測序，

7、對于未知序列可采用單鏈測序，而對于已知DNA序列可采用雙鏈測序。但不管單鏈測序還是雙鏈測序，其測序反應都一樣。 其中單鏈模板可通過將待測DNA片段克隆到噬菌體M13中或通過不對稱PCR制備 ；雙鏈模板可通過將待測DNA片段克隆到質粒DNA中或通過PCR擴增制備。所得模板DNA應通過純化處理才能用于后繼測序反應。,二. 測序引物的設計,測序所用引物一般采用通用引物，也可根據(jù)已有序列設計引物，引物一般有15～30個堿基，應遵循一般

8、引物設計原則。 引物設計原則： 1、G+C含量為45～55%。 2、3端最好以A或C結尾，不要以T結尾。 3、引物長度以15～30bp為宜。 4、引物本身不能形成二級結構。,三. 四種測序反應液的制備,測序反應液組成：反應緩沖液、DNA聚合酶、Mgcl2、引物、純水、四種dNTP，分別在四個反應管中加入一種相應ddNTP。標記物：測序反應的標記物有核素和熒光染料。標記載體有引物、dNTP

9、、ddNTP?，F(xiàn)在應用較多的是將熒光染料標記于引物或ddNTP上，因核素對環(huán)境的污染而逐漸應用得比較少。但也可以不進行標記而采用銀染系統(tǒng)檢測。,四. 延伸反應,引物在DNA聚合酶的催化下，按堿基互補配對原則逐步在引物的3’端加上四種脫氧核糖核苷酸。四個反應管中的ddNTP隨機地與dNTP竟爭結合位點，于是引物延伸鏈隨機終止在各個可能位點，形成一系列相差一個核苷酸的單鏈DNA分子。,五.電泳與讀序,反應產(chǎn)物與甲酰胺混和，并高溫加熱變性

10、后，于變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。對于沒有標記的測序反應，電泳完成后可用銀染將DNA標記、拍照、讀序。對于用核素標記的測序反應，按核素操作規(guī)程拍照。對于用熒光染料標記的測序反應，現(xiàn)有一些商業(yè)生物技術公司開發(fā)的測序儀可在電泳過程中進行檢測。,末端終止法圖示,ACGTTGCACGTA,,,,,,A反應管AACGTTGCAACGTTGCACGTA,C反應管ACACGTTGCACGTTGCAC,G反應管ACGACGTTG

11、ACGTTGCACG,T反應管ACGTACGTTACGTTGCACGT,TGCAACGTGCAT,T泳道,,化 學 裂 解 法,首先對待測DNA單鏈單側末端進行放射性標記，再分成4～5個反應體系，分別用不同的化學試劑處理，DNA片段分別于某一種或某一類堿基處斷裂，而斷裂的堿基隨機發(fā)生于DNA片段上某種或某類堿基中的任何一個,且每一個DNA分子只有一處斷裂點。電泳后，放射自顯影得到相互錯落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列。,化學測序

12、反應機理,G反應：硫酸二甲脂(DMS)使鳥嘌呤N7甲基化。A+G反應：甲酸使嘌呤環(huán)的氮質子化而使糖苷鍵被削弱，進而嘌呤環(huán)被吡啶取代。C+T反應：肼裂解嘧啶環(huán)，導致其脫落。C反應：在一定濃度的NaCl存在時，肼只對胞嘧啶起作用。 以上反應完成后，吡啶在加熱條件下導致被修飾堿基處磷酸二酯鍵斷裂。,化學測序法操作步驟,1.待測單鏈DNA的純化和標記2.堿基的特異性修飾3.堿基的裂解4.上樣電泳5.測序圖譜識讀,5’

13、 *p GATCGGACCT 3’,G反應,G+A反應,T+C反應,C反應,,*GATCGGACCT*GATCGGACC*GATCGGAC*GATCGGA*GATCGG*GATCG*GATC*GAT*GA*G,,,,,,,,,,,,,,,,,化學裂解法的特點,優(yōu)點：1、所測序列直接來源于所測DNA，避免了DNA復制中錯誤dNTP的摻入。2、可直接對合成的寡核苷酸測序，可分析甲基化修飾等，以及研究DNA的二級結構及

14、蛋白質與DNA的相互作用等。缺點：操作復雜，讀序困難。,雜 交 測 序,雜交測序是以基因芯片為基礎的一種測序方法，將一段DNA片段分解為一系列相差一個堿基的八聚體，將這些八聚體做成基因芯片與待測DNA雜交，根據(jù)雜交結果拼湊出所測DNA序列。,雜交測序詳解,TCACGATCCTTAGGCAC 測序模板AGTGCTAG GTGCTAGG TGCTAGGA GCTAGGAA

15、CTAGGAAT TAGGAATC AGGAATCC GGAATCCG GAATCCGT AATCCGTG,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Genechip,基 因 芯 片,Applied Biosystem

16、公司 310 型遺傳分析儀介紹,ABI公司專業(yè)生產(chǎn)各種PCR儀和電泳儀，本次所介紹的ABI PRISM 310遺傳分析儀為ABI公司生產(chǎn)的單毛細管電泳系統(tǒng)，由電泳系統(tǒng)、激光信號檢測系統(tǒng)、計算機分析系統(tǒng)等組成。能用于基因掃描、DNA測序分析等。,基因掃描 (Gene Scan),基因掃描可用于檢測待測物種的有無、單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP)、基因突變等檢測。,DNA測序分析,ABI PRISM 310遺傳分析儀可用于DNA測序分析，四

17、種雙脫氧核苷酸堿基帶有四種不同的熒光染料，利用雙脫氧末端終止法測序。經(jīng)過一根盛有變性聚丙烯酰胺凝膠的毛細管電泳，長短不同的DNA片段依次通過激光檢測窗口，由CCD攝像機收集熒光信號，再由機算機測序分析軟件對所收集的信號進行分析。 測序速度高達200bp/小時，一個樣品一次可測定700多個堿基。,,激光,,,,,CCD攝像機,,,,,,,,,,ddATP,,,ddTTP,,ddGTP,,ddCTP,DNA測序儀的應用,1、基因組測序

18、2、基因突變分析3、基因連鎖圖譜和指紋圖譜4、基因表達5、疾病的基因診斷,DNA測序檢測,亨廷頓病(Huntington’s disease，HD) 亨廷頓病是以神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變?yōu)橹饕卣鞯某Ｈ旧w顯性遺傳病。1993年發(fā)現(xiàn)HD基因，并揭示IT15基因的不穩(wěn)定突變，即IT15基因5’端編碼區(qū)CAG三個核苷酸的異常擴展性重復是HD的遺傳學基礎。,病例來源：江蘇徐州HD家系 ：7例患者，30例HD風險者。浙江慈溪H

19、D家系：1例患者，9例HD風險者提取受檢者外周血白細胞基因組DNA，先進行PCR擴增IT15基因，接著進行DNA測序反應，,檢 測 結 果 IT15基因在正常人中其(CAG)的重復數(shù)呈多態(tài)性，其拷貝數(shù)在13~26之間。 HD的IT15基因的(CAG)拷貝數(shù)均大于40，大多數(shù)為45~50。,亨廷頓病發(fā)病預測 IT基因的(CAG)拷貝數(shù)的多少與亨廷頓病的發(fā)病年齡呈正相關，(CAG)拷貝數(shù)在45~50時，

20、發(fā)病年齡為40歲左右；(CAG)拷貝數(shù)在50以上時，其發(fā)病年齡在20~30歲之間。,亨廷頓病的發(fā)病機制 亨廷頓病是由IT基因的(CAG)重復序列的重復數(shù)太多引起的，CAG可編碼谷氨酰胺，由于CAG的重復數(shù)太多，則由CAG編碼的谷氨酰胺在IT基因編碼的蛋白質中大量積累，從而影響蛋白質的正常功能。,DNA測序在亨廷頓病中的應用 根據(jù)亨廷頓病的發(fā)病機制，可以利用DNA測序技術進行亨廷頓病的預測和診斷?？沙槿⊙蛩毎崛∑?/p>

21、DNA后，用PCR擴增IT基因的目地片段進行測序，檢測其(CAG)拷貝數(shù)的多少，根據(jù)CAG重復數(shù)的多少預測胎兒出生后患HD的風險系數(shù)，決定是否終止妊娠。,乙型血友病的DNA測序檢測血友病可分為甲型血友病和乙型血友病兩種血友病的臨床癥狀相似，出血部位為肌肉、關節(jié)及深部組織，直到1952年才用凝血活酶生成實驗(TGT)及部分凝血活酶時間(PTT)測定實驗將兩種血友病分開。,,,,Y X正常男性,,,Y X血友病

22、男性,,,,,,,,,,,,,,X X正常女性,X X血友病女性,X X攜帶者女性,,正?；?,血友病基因,目前研究發(fā)現(xiàn)導致乙型血友病發(fā)生的FⅨ基因功能障礙的基因突變種類繁多，大約有400種左右，由于乙型血友病基因較小，對乙型血友病可以測定基因的序列作出診斷。,從36例乙型血友病患者中共檢出17位女性為突變基因攜帶者。檢測出女性攜帶者后，可對該婦女開展產(chǎn)前診斷，如果發(fā)現(xiàn)了胎兒為血友病患者或血