病毒學研究方法簡介

1、病毒學研究方法簡介,生物安全實驗室,P1實驗室——研究的病毒危險性較低，試驗人員連口罩都不用帶，穿上白大褂就可以了，試驗人員在這里很放松；P2實驗室——研究的是中度危險的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防護性較好的口罩；P3實驗室——研究的是高度危險的病毒，傳染性很強，而且沒有疫苗，試驗人員的保護措施要比P1/P2實驗室嚴密得多；P4實驗室——全球級別最高的生物安全實驗室，研究的是極度危險的病毒，如令人談之色變的埃博拉病毒、馬

2、爾堡病毒，進入這種實驗室的工作人員，處于防護服的嚴密保護之下，連空氣都不能在實驗室內呼吸，紅色螺旋狀管子，是專門用來向室內輸送新鮮空氣的，試驗人員一進入實驗室，要先屏住呼吸，馬上接上這種管子，然后才能呼吸。,,根據微生物及其毒素的危害程度不同，分為４級，一級最低，四級最高。,病毒學研究的主要方法,生物學特性測定:在宿主上的反應——癥狀、傳播等病毒分離與培養(yǎng)：提純與純化、二元培養(yǎng)法光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應抗血清的特異免疫

3、吸附情況免疫學技術：以血清學和組織免疫化學方法檢測帶毒情況、多克隆抗體、單克隆抗體分子生物學技術：核酸分子雜交、PCR等,一、生物學特性測定,在宿主上的反應 宿主范圍、癥狀表現、傳播方式等 病毒的理化性質 病毒粒子的形態(tài)、大小、對理化因子的耐受性、 體外存活期等 病毒接種方法 注射接種、病毒組織培養(yǎng)技術 植物病毒——汁液摩擦接種、昆蟲介體接種、嫁 接接種、菟絲子接種法等,巨細胞病毒感染

4、細胞的典型“貓頭鷹眼”樣核內包涵體,冠狀病毒感染——“非典”X線胸部檢查可見肺部不同程度的片狀陰影，少數病人進展迅速，呈大片狀陰影，大多數為雙側改變，陰影吸收消散較慢。,TMV transmission by an Apis sp.,A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV),腿色斑Chlorotic spoting,黃化Yellowing,病毒檢測,二、病毒的分離與鑒定,,提純extra

5、ction/純化purification,病毒的分離與鑒定,病毒的提純是將宿主中的病毒粒子與宿主細胞組分區(qū)分開來的過程。 原理是利用病毒的蛋白質和大分子粒體的特性，及其與宿主細胞組分在理化特性上的差異將病毒粒子區(qū)分出來，并盡可能保持侵染力。 目的是確切地研究病毒理化、生物學特性、化學組分、組成、增殖過程及機制，還可用于制備高效價的抗血清。,1953年，斯坦利第一次提取并結晶了 TMV，這是病毒學史上一個重要

6、的里程碑。,（一）病毒的純化與提純,,一般純化方法動物病毒的純化：從空斑、病斑分離，用終點稀釋法植物病毒的純化：如確定是一種病毒，且可機械摩擦接種，則接種到適當寄主上；如可能有多種病毒，則要嫁接傳染，先將病毒保存，然后試用蟲媒或其他方法分離。,二、病毒的分離與培養(yǎng),,,1、差速離心和密度梯度離心 差速離心：交替使用高速和低速離心高速離心（40000~80000g）使病毒沉淀，取沉淀低速離心（約4000g）僅去除大的細胞碎片

7、等雜質，取上清 密度梯度離心：部分或完全根據顆粒在一個無對流介質中的密度而獲得分離 蔗糖10%~40% CsCl等,（三）病毒提純的技術,二、病毒的分離與培養(yǎng),,,2、沉淀法 簡便快速但粗糙易變性鹽析法 硫酸銨濃度達30~50%飽和度時多數病毒沉淀等電點沉淀 加醋酸或鹽酸丙酮沉淀 濃度達40~70%聚乙二醇沉淀 濃度達4~8%乙醇沉淀

8、 濃度達20% 沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸 銨沉淀3、吸附法 磷酸鈣、離子交換樹脂、羧甲基纖維素4、酶處理 許多病毒抗蛋白酶和核酸酶,（三）病毒提純的技術,二、病毒的分離與培養(yǎng),,,5、有機溶劑萃取有機溶劑可溶掉脂肪、有色雜質或非病毒的變性蛋白，如脊髓灰質炎病毒提純中用正丁醇：要考慮病毒對有機溶劑的耐受性,（三）病毒提純的技術,

9、,,,脂肪,變性非病毒蛋白,病毒,水,醇,,,,,,二、病毒的分離與培養(yǎng),,,6、電泳法 普通電泳、密度梯度電泳、等電聚焦電泳等7、柱層析法 吸 附：用離子交換或吸附法 分子篩：瓊脂糖或葡聚糖制成凝膠柱8、抗血清處理 針對宿主蛋白的血清來沉淀雜蛋白 加病毒的抗血清形成病毒—抗體復合物,（三）病毒提純的技術,二、病毒的分離與培養(yǎng),要證明某種疾病是某一感染因子所引

10、起．則必須滿足Rivers法則：① 從患病者體內分離出病毒；② 在實驗動物或寄主細胞中可以培養(yǎng)；③ 證明這種培養(yǎng)物具有濾過性；④ 在原始宿主或相關種內能產生同樣的病癥；⑤ 能重新分離出病毒。病毒的分離與鑒定組成了病毒學診斷技術的主體。病毒分離(virus isolation)是診斷病毒感染的“金標準”(goldstandard)。,二、病毒的分離,病毒的分離,組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)動物接種,,組織培養(yǎng)：原代細胞：新鮮組織+

11、胰蛋白酶消化，分散+培養(yǎng)液 成——單層細胞二倍體細胞株：原代細胞傳代（為二倍體細胞）傳代細胞系：腫瘤組織或二倍體細胞自發(fā)轉化（非整倍體）,二、病毒的分離與培養(yǎng),,卵黃囊接種：用5~8d雞胚，以細長針由氣室端刺入卵黃囊，孵育后收集卵黃囊膜檢查。常用于一些嗜神經病毒羊膜腔：用12~14d雞胚，將檢材注入羊膜腔，孵育后取羊水檢查。常用于流感病毒的初次分離尿囊腔：用9~12d雞胚，將標本接

12、種于尿囊腔，孵育后取尿囊液檢查。常用于培養(yǎng)流感病毒和腮腺炎病毒等絨毛尿囊膜：用10~12d雞胚，無菌下開一小窗，將材料滴在絨毛尿囊膜上，孵育后觀察膜上有無斑點病變。常用于培養(yǎng)單純皰疹病毒，天花病毒和痘病毒,雞胚接種,絨毛尿囊膜痘病毒特異性損傷,3. 動物接種,常用動物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒對動物的敏感性不同，根據病毒種類加以選擇。接種途徑 按病毒侵襲部位選擇相應的接種途徑：乙型腦炎病毒及狂犬

13、病毒 小鼠腦內接種柯薩奇病毒 乳鼠腹腔接種乙肝病毒 黑猩猩靜脈注射流感病毒 鼻腔滴種用途 分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清,標本制備 濃縮標本有以下幾種方法：① 超速離心 離心的時間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心機轉頭的半徑，一般是30min到3h．沉淀的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網上；② 超過濾法 用于分子篩的蛋白質相對分子質量為10000；③ 接種細胞 接種細胞增殖病毒，然

14、后快速包埋、切片；④ 免疫凝集 如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮病毒,三、病毒的光鏡與電鏡觀察法,光 鏡：宿主組織切片、包涵體,三、病毒的電鏡觀察法,1、正染法（超薄切片法、病組織）將細胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察病毒顆粒，通常1~2 d完成。操作復雜、費時，但樣品可長期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)生過程。2、負染法直接將病毒懸液(也可用細胞)滴在銅網上，用重金屬(通常用磷鎢酸)進行染色，觀察

15、病毒顆粒，10-20min可出結果。原理：負性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有亮度，在周圍暗背景上顯示亮區(qū)——較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結構。缺點：敏感性低，要求病毒量在107／mL以上，同科病毒難于鑒別。3、投影技術4、膠體金標記技術、與免疫學技術結合等,采用幾種電鏡技術觀察病毒粒子的形態(tài),Orf virus：口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎),Ebola viru

16、s埃博拉病毒（正染技術）,Vaccinia virus 痘苗病毒（投影技術）,負染技術,美國疾病控制和預防中心公布的一張未標明日期的彩色電子顯微照片。它顯示出H5N1型禽流感病毒（金黃色）在MDCK細胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動狀態(tài),電鏡技術的應用,研究病毒形態(tài)、鑒定 觀察病毒的形態(tài)及形態(tài)發(fā)生學過程；亞顯微結構；病毒與宿主細胞的關系；病毒感染細胞的超微結構改變；病毒的分類等。診斷病毒病 檢測不能在體外培養(yǎng)的病毒，如輪狀病毒、星狀

17、病毒、嵌杯病毒、HAV等都是用電鏡最先發(fā)現的——能進一步發(fā)現新的病毒和病毒病。,四、免疫學技術,1、病毒抗原2、病毒抗體3、免疫學診斷方法免疫熒光法(IF)免疫酶法（ELISA）單克隆抗體技術,血凝抑制（HI）試驗,血凝試驗HA,瓊脂擴散試驗,五、病毒抗原檢查,可檢測細胞內、外的游離病毒抗原。敏感、特異，簡便、快速。適用于多種病毒性疾病的早期快速診斷。,Influenzavirus A培養(yǎng)物DFA染色陽性,生殖道HSV-2涂