乙肝病毒基因型與亞型臨床特征及病毒學差異比較研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)基因組全長僅為3200個堿基，包括4個相互重疊的讀框：前C/C基因、P基因、S基因和X基因。依據(jù)核苷酸序列異質性≥8％可將HBV毒株分成不同的基因型。到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了8個HBV基因型：基因型A、B、C、D、E、F、G和H。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地帶且與基因型D有類似的基因特征，異質性最為明顯的F型主要分布于南美及中美洲。HBV幾個主要的基因型中均發(fā)現(xiàn)基因亞型現(xiàn)象的存在。其中基因型A可分為A1-A33個亞型

2、；基因型B可分為B1-B44個亞型；基因型C可分為C1-C44個亞型；基因型D分為D1-D44個亞型；基因型F可分為F1、F2兩個亞型。 結果發(fā)現(xiàn)HBV/C1、HBV/C2是中國地區(qū)最普遍的HBV/C亞型，其中是HBV/C1占71％(393/512)，HBV/C2占27％(112/512)此外，在對全國血清樣本進行基因分型的過程中，我們任意選取PCR-RFLP分型鑒定的基因型B、C、D樣本各3份進行了全序列的測定以判斷該分型方法

3、的準確性。結果發(fā)現(xiàn)，以PCR-RFLP分型鑒定為基因型D的部分樣本測序后比較證實為基因型C，后來的研究顯示該種毒株在S區(qū)與基因型D相同，暫時命名為HBVC/D重組體。并根據(jù)其序列特征建立了該重組體的初步篩選方法。以初步篩選方法對來自甘肅的HBV血清樣本進行了分析，發(fā)現(xiàn)了7例該種重組體；選取其中部分樣本進行HBV全基因序列的測定，測序結果證實重組的存在。這種亞型均為HBV基因型C與基因D毒株的重組體。 因此，在中國大陸地區(qū)至少存在

4、3種HBV/C基因亞型：HBV/C1、HBV/C2、及HBV/C/D。如同基因型呈地域性分布的特點一樣，基因型C亞型在我國不同地區(qū)的分布也有很大差異。在北方地區(qū)，98％以上基因型C毒株均屬于C2亞型，C1亞型罕見；而在南方地區(qū)，55％基因型C毒株為C1亞型，C2占較小比例。HBVC1亞型與C2亞型在各省的分布情況為：北京2％(1/54)與98％(53/54)；山東1％(1/100)與99％(99/100)；云南13％(5/38)與87％

5、(33/38)；湖南19％(3/16)與81％(13/16)；廣東63％(47/75)與37％(28/75)；海南79％(53/67)與21％(14/67)。在東南地區(qū)的福建省，C1與C2的亞型的比例分別為1％(1/72)與99％(71/72)。在中國西部HBV慢性感染人群中，基因型C亞型的情況與其它地區(qū)不同。在甘肅地區(qū)，C亞型的分布比例：C1為1％(1/90)，C2為91％(82/90)，C/D重組體為8％(7/90)。 本研

6、究中還比較了兩種主要C基因亞型C1與C2感染者之間的臨床差異。人口學資料比較發(fā)現(xiàn)，C1亞型感染者年齡較C2亞型感染者小(31.6±12.4vs.34.4±12.0，p=0.03)。盡管C1亞型感染者較C2亞型感染者有較高的HBeAg陽性率，兩者之間并無統(tǒng)計學差異。兩組病例在性別比率、肝功能檢查(ALT水平及總膽紅素水平)及臨床診斷方面未見統(tǒng)計學差異。因此，HBV基因亞型存在的現(xiàn)象對于疾病發(fā)生發(fā)展的影響尚有待進一步研究。 在本研究

7、的第二部分，為研究HBV基因型功能學的差異，使用了腺病毒載體將目的HBV基因導入真核細胞，對不同HBV基因型毒株的表達與復制進行了比較研究。腺病毒(Adenovirus，Ad)分布廣泛，在許多哺乳動物和禽類中都發(fā)現(xiàn)其存在。其中人的腺病毒有50種以上，但通常都較溫和，很少危及生命。腺病毒對于研究真核細胞DNA的復制、轉錄，RNA剪接加工，蛋白質的合成以及細胞轉化做出過重要的貢獻。腺病毒還具有高滴度、高穩(wěn)定性、高轉染效率、非致癌性等特點。此

8、外，對野生型腺病毒進行基因工程改造而制作的重組病毒載體系統(tǒng)，作為哺乳動物細胞表達載體、重組疫苗和基因治療載體也得到了廣泛應用。本研究運用了一種新的重組病毒構建方法AdEasyTM系統(tǒng)，在體外模型中研究不同基因型HBV病毒復制活性差異。首先，我們構建了1.3拷貝HBV/B、HBV/C全基因組，在其5’末端包含增強子Ⅰ及增強子Ⅱ，復制起點，X及前C啟動子基因，前基因RNA轉錄起始位點，特異多腺苷酸化位點以及完整的X開放讀框。這種結構已被證明

9、能在肝臟細胞及轉基因小鼠中進行有效的復制。隨后，將1.3拷貝HBV全基因插入到重組病毒穿梭載體pAdTrack的多克隆位點中，該位點位于CMV啟動子及綠色熒光蛋白(GFP)位點上游，利用該系統(tǒng)，一方面可通過表達的GFP在熒光顯微鏡下觀察重組病毒感染情況，另一方面，構建的1.3拷貝HBV全基因能夠利用病毒自身的調控序列啟動HBV的復制，避免了載體上的外源啟動子對HBV復制及表達的影響。將重組穿梭質粒與腺病毒骨架載體pAdeasy-1共轉化

10、E.coliBJ5183細菌使之內重組。在細菌中發(fā)生同源重組后，選出重組質粒并酶切鑒定，將鑒定出的重組質粒經PacⅠ線性化后使用脂質體介導轉染293細胞，通過GFP可以監(jiān)測轉染效率和病毒的產生。得到重組腺病毒之后，進行純化和擴增，再使用兩種不同基因型HBV重組腺病毒感染HepG2細胞。使用ELISA法檢測細胞及培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg的表達情況，用美國雅培公司的化學發(fā)光全自動免疫分析儀對細胞及培養(yǎng)上清中的HBsAg及HBeAg

11、進行檢測并進行定量分析；熒光定量法檢測細胞及培養(yǎng)上清中HBV的滴度；免疫組化檢測細胞內HBsAg及HBcAg的表達情況。 結果表明，從我國慢性乙肝病毒感染者血清中獲得的HBV基因型B和C毒株，并經過全序列的測定確定其基因型。通過酶切與連接成功構建了兩種基因型的1.3拷貝HBVDNA，克隆篩選后進行序列測定，證實了兩種基因型1.3拷貝HBVDNA序列正確無誤。為確保所構建的有復制能力的1.3拷貝HBVDNA在病毒復制過程中不受這些

12、重要位點的影響，對測序結果進行仔細核對，并與多株參考序列進行比對，排除了有插入、缺失及重要位點突變的克隆。1.3拷貝HBVDNA序列經雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后，與腺病毒穿梭載體pAdTrack進行連接，連接物轉化JM109細菌，隨機挑取克隆，雙酶切法初步驗證插入序列片段大小的正確性。重組穿梭載體再用YS1-YS2進PCR擴增后，NdeⅠ內切酶消化，驗證插入序列基因型的正確性。兩種基因型的重組穿梭載體分別被命名為AdTrack-HBV

13、-B和AdTrack-HBV-C；轉化感染受態(tài)細菌Adeasier-1感受態(tài)細胞得到兩種基因型的腺病毒重組體：pAdeasier-B和pAdeasier-C，PacⅠ酶切鑒定其正確性。大量提取的重組腺病毒質粒pAdeasier-B和pAdeasier-C用PacⅠ酶切線性化后，用脂質體LIPOFECTAMINE2000轉染293細胞轉染7-10天后，即可在熒光顯微鏡下看見明顯的GFP熒光，隨著培養(yǎng)時間的延長，熒光斑點數(shù)也隨之增多，在普通

14、顯微鏡下可見明顯的病毒蝕斑，293細胞也出現(xiàn)固縮、變圓、脫落、裂解等明顯的細胞病變現(xiàn)象，結果證明了重組病毒的形成和擴增。收獲轉染10天后的293細胞及上清液，反復凍融裂解后，再重新感染293細胞。感染2天后細胞即可看到GFP的表達，細胞也出現(xiàn)變圓、脫落、裂解等明顯的細胞病變現(xiàn)象。收獲二次感染的細胞及上清液，反復凍融裂解后，取上清再次感染293細胞，進行病毒的大量擴增，使兩種基因型的重組腺病毒滴度約為109/ml。研究表明，兩種重組病毒的

15、包裝是成功的，并且均具有很高的滴度，能夠有效的感染293細胞，并有很強的GFP表達。按感染復數(shù)為5的標準，兩種基因型的腺病毒重組體分別感染HepG2細胞。當感染細胞培養(yǎng)至第5天時收集感染細胞及上清，細胞內HBcAg及HBsAg經免疫組織化學法檢測，均有蛋白表達。細胞及上清中的HBeAg和HBsAg用ELISA法進行檢測，結果可明確檢測到HBeAg及HBsAg的表達；上清及細胞內病毒顆粒經定量檢測后有明確的上升，說明我們所構建的1.3拷貝

16、HBVDNA能夠在HepG2細胞內進行表達和復制。分別用兩種不同HBV基因型的重組腺病毒感染HepG2細胞，以后隔日收集感染細胞及清，并分別對上清中的病毒顆粒、HBeAg及HBsAg進行定性及定量檢測。感染第2天時，上清中即可檢測到病毒顆粒、HBeAg及HBsAg。感染第4天時上清中HBeAg及HBsAg的表達量最高，以后隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，HBeAg及HBsAg的表達量呈下降趨勢，HBeAg及HBsAg的表達量C基因型明顯高于B基

17、因型。上清中病毒顆粒的量在第2天時即達最高值，然后隨培養(yǎng)時間的延長呈緩慢下降趨勢，但兩種基因型間病毒定量無差別。在本研究中，我們證明了腺病毒載體能夠將具有復制能力的HBV基因轉導入肝細胞系，并能啟動HBV復制導致完整的具有感染能力的HBV顆粒的產生，這說明導入的HBVDNA能在被轉染的細胞中復制。腺病毒介導的HBV轉染成功將為我們進一步研究病毒在細胞內的復制能力，比較不同的病毒株復制能力的差異，以及各病毒蛋白在病毒生活周期中的作用提供新