拉米夫定耐藥的臨床與病毒學(xué)研究.pdf

1、研究背景:
　　 乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染呈世界件流行,全球約20億人曾感染過(guò)HBV,其中3.5億人為慢性HBV感染者,每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)。我國(guó)HBV感染率較高,1-59歲人群的HBsAg陽(yáng)性率為7.18％,慢性HBV感染嚴(yán)重危害著我國(guó)人民的健康。抗HBV治療是慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)治療

2、的關(guān)鍵,拉米夫定(lamivudine,LAM)是最常用的抗HBV藥物之一,它能有效抑制HBV復(fù)制,減少肝臟的炎癥活動(dòng),延緩或阻止肝臟疾病的進(jìn)展,減少肝癌的發(fā)生率。然而,長(zhǎng)期的LAM治療會(huì)篩選出YMDD變異株(rtM204V/I/S),從而產(chǎn)生了LAM的耐藥。
　　 阿德福韋酯(adefovir dipvoxil,ADV)是阿德福韋的前體口服藥物,除了可以有效地抑制HBV野生毒株復(fù)制,體內(nèi)和體外研究都證實(shí)阿德福韋可以有效地抑制Y

3、MDD變異株的復(fù)制,因而被廣泛應(yīng)用于LAM耐藥患者的救援治療。聚乙二醇干擾素α-2α(派羅欣,Pegasys)是一種長(zhǎng)效干擾素,它的半衰期長(zhǎng),一周一次的給藥可以提高治療末應(yīng)答和持久應(yīng)答率,優(yōu)于傳統(tǒng)干擾素,是LAM耐藥患者救援治療的一個(gè)可能選擇。
　　 研究表明,使用ADV單藥治療后,LAM耐藥患者體內(nèi)的YMDD變異株會(huì)逐漸消失,野生株逐漸取代YMDD變異株成為HBV準(zhǔn)種中的優(yōu)勢(shì)株。使用派羅欣治療后LAM耐藥患者體內(nèi)的YMDD變異

4、株將如何變化,目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。
　　 研究目的:
　　 1、探討派羅欣治療后YMDD變異株的動(dòng)態(tài)變化,比較派羅欣及ADV作用下YMDD變異株動(dòng)態(tài)變化之間的差異。
　　 2、探索停止LAM治療后YMDD變異株的演化情況及YMDD變異株的演化與抗HBV療效之間的關(guān)系。
　　 3、比較ADV單藥和聯(lián)合LAM治療LAM耐藥患者的臨床療效,為選擇合適的抗HBV方案對(duì)LAM耐藥患者進(jìn)行救援治療提供線索。
　　

5、 研究方法:
　　 1.停止LAM治療后YMDD變異的逆轉(zhuǎn):
　　 1.1 樣本來(lái)源:所有患者均來(lái)自2005年到2008年間我科參加的ML18376臨床試驗(yàn):LAM耐藥HBeAg陽(yáng)性CHB患者以2:1的比例隨機(jī)分配到A(PEG組)、B(ADV組)兩組,我科兩組入組患者分別為25例、15例。A組患者給予Pegasys180μg 1/周治療48周,停藥后隨防24周；B組患者給予ADV10mg/d治療72周；所有患者在頭12

6、周內(nèi)均聯(lián)合使用LAM100mg/d治療。
　　 1.2 HBV DNA抽提:收集患者12周、16周、24周、48周、72周等時(shí)間點(diǎn)的系列血清,用DNA抽提試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)從血清(每個(gè)血清樣本使用量為200μl)中提取HBV DNA。
　　 1.3 HBV RT區(qū)的PCR擴(kuò)增:使用巢式PCR擴(kuò)增HBV RT區(qū),第二輪PCR產(chǎn)物直接送上海英駿公司測(cè)序。
　　 1.4 測(cè)序結(jié)

7、果分析:測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank報(bào)道的A-G基因型別的HBV序列進(jìn)行同源件比對(duì),用HBV S區(qū)做進(jìn)化樹(shù)來(lái)進(jìn)行基因分型。序列比對(duì)用MEGA4軟件進(jìn)行,測(cè)序峰圖用Chromas軟件分析。
　　 1.5 統(tǒng)計(jì)分析:所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,率的比較用x2檢驗(yàn)分析。所有結(jié)果均采用雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.停止LAM治療后YMDD變異株的克隆演化:
　　 2.1 樣

8、本來(lái)源:所有4位患者均來(lái)自ML18376臨床試驗(yàn)。
　　 2.2 HBV DNA抽提、HBV RT區(qū)的擴(kuò)增:同前,擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收,回收產(chǎn)物一部分送上海英駿公司測(cè)序,一部分用于下一步實(shí)驗(yàn)。
　　 2.3 HBV RT區(qū)的克隆分析:將PCR純化產(chǎn)物與pMDTM 19-T Vector連接后轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有Ampicillin、IPTG、X-Gal的LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。每個(gè)血清樣品

9、隨機(jī)挑選30個(gè)白色克降在LB培養(yǎng)基中37℃225rpm振蕩培養(yǎng)6至8小時(shí)。經(jīng)PCR鑒定后將所有陽(yáng)性菌液送上海英駿公司測(cè)序,最終有來(lái)自18個(gè)血清樣本的370個(gè)克隆成功測(cè)序。
　　 3、阿德福韋酯單藥和聯(lián)合LAM治療LAM耐藥HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎的療效比較:
　　 對(duì)24例ADV單藥及28例ADV聯(lián)合LAM治療的LAM耐藥HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎進(jìn)行回顧性分析,比較兩組患者在HBV DNA、ALT水平及HBV DNA

10、檢測(cè)不到率、ALT復(fù)常率上的差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、停止LAM治療后,野生株在HBV準(zhǔn)種中的比例會(huì)逐漸增加并最終取代YMDD變異株成為HBV準(zhǔn)種中的優(yōu)勢(shì)株。
　　 2、大多數(shù)患者體內(nèi)的YMDD變異株在停止LAM治療4周后發(fā)生逆轉(zhuǎn),rtL80V/I、rtL180M等補(bǔ)償變異能減慢YMDD變異逆轉(zhuǎn)的發(fā)生。
　　 3、rtL80V/I、rtL180M、rtM204V/I三者通常連鎖發(fā)生于同一HBV毒株上