血清和關節(jié)液中ykl對骨性關節(jié)炎

1、血清和關節(jié)液中YKL-40對骨性關節(jié)炎診斷價值的研究,導 師: 衛(wèi)小春教授研究生: 王國金,科研開題報告,一、課題簡介,關節(jié)軟骨特性：光滑、耐磨、富有彈性及一些特有的機械性能 功能：傳導載荷、吸收震蕩、潤滑關節(jié),,由于關節(jié)軟骨沒有血管、神經，一旦損傷，很難自我修復(once destoryed，is not repaired),Alginate,實驗流程圖,謝謝！,前言,關節(jié)軟骨是一種高度分化的組織，由于缺乏血供，損傷

2、后很難自我修復（once destoryed，is not repaired）,Autologous Chondrocyte Transplantation（ACT）,1994年， Brittberg,謝謝,國內外曾用多種修復方法來治療軟骨損傷，如刨削成形術、微骨折術、軟骨下骨鉆孔術等，其基本原理是利用生物或機械因素使骨髓中的多能干細胞到達軟骨缺損區(qū)，并進一步分化為軟骨及骨組織。研究發(fā)現(xiàn)形成的軟骨為纖維軟骨或類透明軟骨，且該軟骨容易發(fā)

3、生退變。,謝謝,本研究所屬領域 范圍及性質,骨性關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)生物學標志物(Biomarkers, Biological Markers,marker. BM)的研究領域。采用橫斷面研究的方法,對OA體液中生物學標志物之一— YKL-40(又稱人軟骨糖蛋白-39,human cartilage glycoprtein-39,HC gp-39/GP-39)進行的臨床診斷性試

4、驗 研究。,OA概況(1),OA是引起關節(jié)疼痛和活動受限的常見病變,是世界性的關節(jié)疾病。在美國50歲以上的人群中已成為勞動力喪失的第二大疾患。在我國OA的發(fā)病率:農村為9.6%,城市人群為4.9%。,OA概況(2),OA是以疼痛、腫脹、活動受限、彈響，有時伴關節(jié)積液，以及不同程度的局部炎癥,但無全身癥狀為特點的關節(jié)病。OA的病理生理學特點： 負重部位的不規(guī)則軟骨喪失； 軟骨下骨硬化、囊性變、邊緣骨贅形成

5、 不同程度的滑膜炎癥。,OA診斷的現(xiàn)狀,目前臨床所通用的是1986年美國風濕病協(xié)會關于OA的診斷標準，主要是以癥狀+X線征像為依據(jù)的。現(xiàn)有檢查手段對OA軟骨退變診斷的局限性 MRI X線 其征象改變比軟骨發(fā)生退變遲3-5年。,OA的生物學標志物(BM) (1)----概況,近年來國內外學者欲在OA患者的體液中尋找理想的病變標志物，來及時反映關節(jié)軟骨代謝狀態(tài)和局部病變的進展情況，揭示病情活動或預后

6、，并為臨床提供療效評價的客觀依據(jù)。美國國立衛(wèi)生研究院2000年建議用Biomarker取代marker,這樣可更好地揭示其生物學本質。,OA的生物學標志物(BM) (2)----研究現(xiàn)狀,大量實驗研究已發(fā)現(xiàn)許多能反映OA病情的BM： 反映骨代謝的BM； 反映軟骨代謝的BM； 反映滑膜代謝的BM。 YKL-40：可能是反映軟骨和滑膜代謝的BM之一。 近年來，國外開始進行

7、臨床試驗研究。,OA的生物學標志物（BM）（2）——研究現(xiàn)狀（1）反映骨代謝的BM,合成代謝I型膠原：I型前膠原氨基端前肽, I型前膠原羧基端前肽。非膠原蛋白：骨特異性堿性磷酸酶; 骨鈣素 。分解代謝I型膠原：脫氧吡啶酚, 吡啶酚; I型膠原氨基端端肽, I型膠原羧基端端肽-1,2 。非膠原蛋白：血漿酒石酸鹽耐受性酸性磷酸酶, 骨唾液蛋白。,OA的生物學標志物（BM）（2）——研究現(xiàn)狀（2）反映軟骨代謝的BM,合

8、成代謝Ⅱ型膠原：Ⅱ型前膠原羧基端前肽, ⅡA型前膠原氨基端前肽?？删鄣鞍锥嗵牵毫蛩彳浌撬乇砦?46, 3B3, 7D4。其它蛋白：YKL-40即人軟骨糖蛋白-39 分解代謝Ⅱ型膠原：吡啶酚; Ⅱ型膠原新表位COL2-3/4m, COL2-1/4N1; Ⅱ型膠原羧基端端肽。可聚蛋白多糖：可聚蛋白多糖片斷; 硫酸角質素表位 5D4,AN9P1; 其它蛋白：軟骨寡聚基質蛋白。,OA的生物學標志物（BM）（2）——研究現(xiàn)狀（3）

9、反映滑膜代謝的BM,合成代謝I型和III型膠原： I型前膠原羧基端前肽, III型前膠原氨基端前肽。非膠原蛋白：透明質酸; YKL-40 ; 軟骨寡聚基質蛋白; 基質金屬蛋白酶及其組織抑制因子。分解代謝I型和III型膠原：葡萄糖-半乳糖-吡啶酚; I型膠原羧基端端肽-2。,YKL-40概況,YKL-40（又稱人軟骨糖蛋白-39，human cartilage glycoprtein 39，HC gp-39/ GP-39）在非泌

10、乳期牛的乳清分泌物中被首次發(fā)現(xiàn)的。來源：軟骨細胞、滑膜細胞、單核巨噬細胞和中性粒細胞等。相對分子量為40 000的糖蛋白，含383個氨基酸。由10個外顯子構成的含開放讀碼框架完全互補cDNA序列編譯。是殼質酶(chitinase)糖蛋白家族的成員, 但不具備殼質酶活性。,YKL-40的研究現(xiàn)狀（1）,目前YKL-40的相關研究主要集中于以下領域：類風濕性關節(jié)炎；骨性關節(jié)炎；巨細胞性動脈炎；肝纖維化；乳腺癌和結腸直腸癌，

11、等等。雖然YKL-40的作用機制尚不清楚，但研究表明它與許多組織的重塑和細胞外基質降解有關。,YKL-40的研究現(xiàn)狀（2）,關節(jié)液內YKL-40是軟骨細胞和滑膜細胞的分泌產物。OA患者[Volck] ：YKL-40在關節(jié)液中含量增加；血清水平也升高。Johansen報道：血清和關節(jié)液中YKL-40水平是反映滑膜炎時滑膜合成代謝水平的指標。Volk等的研究表明：YKL-40可能在OA的關節(jié)軟骨降解和重塑形中也起著重要作用。,

12、YKL-40的研究現(xiàn)狀（3）,YKL-40是一個反映滑膜和關節(jié)軟骨代謝的BM?經檢索十年的CBMDisc未發(fā)現(xiàn)國內關于YKL-40在骨性關節(jié)炎方面的研究論文發(fā)表。,OA的生物學標志物（BM）（3）——血清BM研究中的混雜因素,血清BM除反映關節(jié)的病情外，還可能受其它因素的影響：生物節(jié)律的影響腸蠕動的影響體育活動的影響肝腎等疾病的影響年齡和性別的影響手術的影響藥物因素的影響,OA的生物學標志物（BM）（4）--現(xiàn)有臨床

13、診斷性研究論著的局限性,多以OA患者X線征象的Kellgren&Lawrence分級作為“金標準”，來對照評價OA病情嚴重程度。充分考慮混雜因素控制的相關論著也不多見。,本研究目的,明確關節(jié)液（synovial fluid, SF）中YKL-40水平對膝OA的診斷價值；探討血清（Serum）中YKL-40水平對膝OA的診斷價值。,本研究的特點,診斷試驗的“金標準”關節(jié)鏡下關節(jié)軟骨損傷和滑膜炎病理變化程度的評分；WOMAC

14、骨性關節(jié)炎指數(shù)（由患者自我評估）；X線的Kellgren&Lawrence分級，負重位X線的膝關節(jié)間隙寬度。充分控制混雜因素探討血清YKL-40診斷價值。,本研究的意義,學術意義可以明確YKL-40對OA的診斷價值；可為OA的癥狀解釋、早期診斷及其分期提供一種實驗室檢查手段；可為OA的治療提供一種療效評價的客觀指標；可為進一步研究確定國人體液YKL-40的正常參考值奠定基礎。 經濟效益近期效益；遠期效益。,

15、統(tǒng)計學分析,X線評價,體液YKL-40的檢測（ELISA）,體液標本的預處理和儲存,OA病變程度的評價,術中關節(jié)鏡下觀察,采集關節(jié)液標本,采集血液標本,膝關節(jié)鏡手術時,術前化驗時,病例選擇,關節(jié)軟骨退變和滑膜炎關節(jié)鏡分級,關節(jié)液和血清YKL-40濃度,Kellgren&Lawrence 分級,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,技術路線,,,功能評估,,,,WOMAC指數(shù),,,,,專業(yè)結論,,技術關鍵

16、,體液標本的采集和預處理體液標本的檢測統(tǒng)計學的統(tǒng)計處理,研究方法（1） ——病例選擇,病例來源：山醫(yī)二院骨科行膝關節(jié)鏡檢查和膝關節(jié)置換術的患者。擇入標準:非發(fā)育期患者（年齡＞18歲）；排除肝腎疾病、全身感染和癌癥等的患者；體液標本采集前兩月未使用糖皮質激素類藥物的患者。樣本含量：≥60例。,研究方法（2）——體液標本的采集、預處理、儲存和檢測,體液標本的采集、儲存前處理、儲存和取用、以及檢測前處理和檢測，應依據(jù)課題技術

17、規(guī)范進行。本課題相關技術規(guī)范主要參考《Poole R. NIH White Paper: Biomakers, the Osteoarthritis Initiative (A Basis for Discussion). Ferbruary 3rd,2000.》制定。,技術規(guī)范（1） ——體液標本的采集,體液標本的采集規(guī)范血液標本在清晨6-8時空腹抽取靜脈血5ml，留存于無菌非抗凝試管中送檢。并應限制病人在采集標本前活動。關節(jié)

18、液標本在行關節(jié)鏡手術時麻醉后采集：抽取關節(jié)液原液留存于無菌非抗凝試管中（盡量多抽?。?。,技術規(guī)范（2）——體液標本的儲存前處理,體液標本均應在采樣后2小時內進行離心處理：血清標本：在至少×600g，3000rpm， 10分鐘的條件下離心。關節(jié)液標本：在×2500g，4℃，15分鐘的條件下離心。 （4500rpm，20min）,技術規(guī)范（3） —體液標本的儲存和取用,體液標本的儲存標本離心后取上清液，經快速冷

19、凍后, -70℃條件下凍存。體液標本的取用在室溫下復溫解凍。標本避免反復凍融。,技術規(guī)范（4） ——體液標本檢測前處理和檢測,體液標本的檢測前處理關節(jié)液標本應先經離心后，取上清液測定其含量；血清標本不需進行特殊處理。體液標本的檢測ELISA法。,研究方法（3）——其它相關資料的收集,臨床資料一般資料；臨床癥狀、體征；問卷調查：WOMAC指數(shù)實驗室檢查資料常規(guī)項目，血清Ⅳ型膠原。X線資料關節(jié)間隙的寬度；K

20、ellgren&Lawrence分級。 手術資料關節(jié)軟骨損傷和滑膜炎程度的評分；手術錄像資料。,技術規(guī)范（5） ——手術資料收集的注意事項,手術中對關節(jié)內組織的病變程度進行評價：關節(jié)軟骨損傷：Outerbridge膝關節(jié)軟骨損傷評分法；滑膜炎：Ayral膝滑膜炎評分法。術中對病變部位用探鉤進行相對測量，并注意留存錄像資料。,研究方法（4）—OA病變程度的對照評價標準,關節(jié)組織的關節(jié)鏡征象評價標準關節(jié)軟骨退變程

21、度：Outerbridge法 ；滑膜炎程度： Ayral膝滑膜炎評分法。OA病變程度的X線征象評價標準Kellgren&Lawrence 分級；負重位的膝關節(jié)間隙寬度。OA病變程度的患者自我評估標準WOMAC骨性關節(jié)炎指數(shù)。,研究方法（5）—統(tǒng)計學處理,使用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析OA組和非OA組之間體液YKL-40水平的比較用多元協(xié)方差分析。體液YKL-40水平與關節(jié)鏡下相關組織的病變程度評分之間用

22、多元線性回歸。體液YKL-40水平與膝關節(jié)間隙寬度或WOMAC評分間用相關分析。,可能遇到的問題及解決辦法,標本的采集、預處理和檢測等的標準化嚴格依據(jù)課題技術規(guī)范進行，才能保證結果的有效性和可比性?；祀s因素的控制探討血清YKL-40水平對OA診斷價值的關鍵。,混雜因素的控制（1）,生物節(jié)律影響的控制血液標本的采集在固定時間（清晨6-8時）進行。腸蠕動影響的控制血液標本在清晨空腹時采集。體育活動影響的控制采集血液標本前限

23、制病人的體育活動。,混雜因素的控制（2）,肝腎等疾病影響的控制選擇肝腎功能均正常的病例；若樣本含量不足時，用統(tǒng)計學方法進行控制。經術前檢查可排除全身感染和腫瘤等的影響。年齡和性別影響的控制采用統(tǒng)計學方法進行控制。,混雜因素的控制（3）,手術影響的控制由于體液標本是在麻醉后手術前采集的，故麻醉的影響可忽略。藥物因素影響的控制采集標本前兩月內未使用糖皮質激素類藥物。,進度安排,2005年1月~2005年4月文獻檢索，課題設

24、計，課題技術規(guī)范的制定,開題報告。2005年5月~2005年9月標本的采集和預處理，臨床和手術資料的收集。2005年10月~2005年12月預實驗，部分體液標本YKL-40含量的測定，分析關節(jié)液和血清YKL-40水平與膝骨性關節(jié)炎WOMAC評分和X線分級的相關性。2006年1月~2006年2月體液標本YKL-40含量的測定，分析關節(jié)液和血清YKL-40水平與膝關節(jié)鏡下相關組織大體病理變化程度的相關性。2006年3月~200

25、6年6月數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計分析，撰寫論文,論文答辯。,開題條件（1）——學術及技術條件,研究人員衛(wèi)小春教授 長期從事關節(jié)軟骨損傷的研究,具有豐富的臨床經驗和很強的科研能力.能及時把握國際上關節(jié)軟骨損傷研究的最新進展。主持承擔國家863計劃一項及省部級科研項目多項，在國內外期刊上發(fā)表論文多篇。 文獻和技術準備已檢索并熟讀了大部分相關核心文獻，了解該領域的研究進展、YKL-40的檢測方法。 病源及標本來源山醫(yī)二院骨科病源充足；課

26、題所需的體液標本較易獲得。,開題條件（2）——實驗設備條件,山醫(yī)二院所具備的實驗條件手術室：關節(jié)鏡設備；骨科實驗室：酶標儀及相關波長的濾光片、深低溫冰箱、低速離心機、高速離心機、電熱恒溫孵育箱、電子天平、普通冰箱；放射科：拍片相關設備。,開題條件（3）——經費預算,科研業(yè)務費 3000元 實驗材料費 7000元 儀器設備費 4000元 協(xié)作費

27、 1500元 科研組織費 2000元 合 計 17500元,參考文獻,Poole R. NIH White Paper: Biomakers, the Osteoarthritis Initiative (A Basis for Discussion). Ferbruary 3rd,2000.Morgante M, Metelli

28、 MR, Morgante D. Observations on the increased serum levels of YKL-40 in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Minerva Med. 2001;92(3):151-3. Johansen JS, Olee T, Price PA, et al. Regulation of YKL-40 p

29、roduction by human articular chondrocytes. Arthritis Rheum. 2001;44(4):826-37. Volck B, Johansen JS, Stoltenberg M, et al. Studies on YKL-40 in knee joints of patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Invol

30、vement of YKL-40 in the joint pathology. Osteoarthritis Cartilage. 2001 ;9(3):203-14. Kawasaki M, Hasegawa Y, Kondo S, et al. Concentration and localization of YKL-40 in hip joint diseases. J Rheumatol. 2001;28(2):341-5

31、. Vos K, Steenbakkers P, Miltenburg AM, et al. Raised human cartilage glycoprotein-39 plasma levels in patients with rheumatoid arthritis and other inflammatory conditions. Ann Rheum Dis. 2000;59(7):544-8. Johansen JS,

32、 Hvolris J, Hansen M, et al. Serum YKL-40 levels in healthy children and adults. Comparison with serum and synovial fluid levels of YKL-40 in patients with osteoarthritis or trauma of the knee joint. Br J Rheumatol. 1996