《病毒學(xué)總論》

1、病 毒 學(xué)virology,病毒的基本性狀,3000BC，埃及孟非思壁畫中長老患小兒麻痹癥。,什么是病毒？,病毒是一類體積微小、結(jié)構(gòu)簡單、只含有一種類型的核酸、嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的、對抗生素不敏感，而對干擾素敏感的非細(xì)胞型微生物。,病毒與其它微生物的區(qū)別,第一節(jié) 病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成,病毒體(virion)：具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)和感染性的完整病毒顆粒。,一、病毒的大小和形態(tài)大小：50－250nm左右。形態(tài)：球形、桿狀或絲狀、磚形

2、、子彈形、蝌蚪形等。,,,,,,,,,,,,,,,葡萄球菌(1000nm）,,,,,,,,,牛痘病毒300×250nm,A,B,C,D,E,F,G,立克次體450nm,,,衣原體390nm,A、大腸桿菌噬菌體 ( 65 ×95nm ),B、腺病毒 (70nm ),C、脊髓灰質(zhì)炎病毒 (30nm ),D、乙腦病毒 ( 40nm ),E、蛋白分子

3、 (10nm ),F、流感病毒 ( 100nm ),G、煙草花葉病毒,二、病毒的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成基本結(jié)構(gòu)： nucleocapsid 輔助結(jié)構(gòu)：viral envelope,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,病毒體結(jié)構(gòu)模式圖,,,,殼粒,,,衣殼,,,核心

4、（核樣物）,,,,,核衣殼,,包膜,,包膜病毒,,,,,包膜子粒（刺突）,化學(xué)組成－病毒核酸,? 分子量差別顯著：3ＫＢ－400ＫＢ;? 多種形式存在：ＲＮＡ 或ＤＮＡ；? 不同形式復(fù)制；? 病毒基因組可相互重疊，轉(zhuǎn)錄的ＲＮＡ前體可以多種方式拼接；? 與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)相似，有內(nèi)含子及非編碼區(qū)；? 具有感染性。,化學(xué)組成－病毒蛋白質(zhì)? 結(jié)構(gòu)蛋白：capsid, envelope protein? 非結(jié)構(gòu)蛋白：酶: 與病

5、毒復(fù)制有關(guān)的酶； 與致病有關(guān)的酶； 調(diào)控蛋白：HIV Tat,rev etc;,病毒衣殼—病毒20面體立體對稱模式圖,不同病毒核酸結(jié)構(gòu)不同，殼粒數(shù)目和排列也不相同。根據(jù)殼粒的排列方式稱為對稱，病毒結(jié)構(gòu)由以下幾種對稱型：,Icosahedral symmetry（二十面體立體對稱型）,,病毒衣殼—螺旋對稱模式圖,病毒衣殼—復(fù)合對稱模式圖,,衣殼的主要功能： 保護(hù)病毒核酸 參與感染過程 具有抗原性,病毒衣

6、殼—電鏡照片,病毒包膜—電鏡照片,包膜的主要功能： 維護(hù)病毒體結(jié)構(gòu)的完整性 與病毒入侵有關(guān) 具有抗原性,第二節(jié) 病毒的增殖,一、virus replication circle:吸附(Adsorption)穿入(Penetration)脫殼(Uncoating)生物合成(Biosynthesis)裝配與釋放(Assembly and Release),1. 吸附 Adsorption（幾分至幾十分鐘）,2-3. Pene

7、tration、Uncoating,融合---有包膜病毒胞飲---無包膜病毒直接穿入,,在溶酶體酶作用下，脫殼。,4.生物大分子合成 Biosynthesis（隱蔽期）,6大類型：雙鏈DNA病毒 單鏈DNA病毒 單正鏈RNA病毒 單負(fù)鏈RNA病毒 雙鏈RNA病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒區(qū)域：DNA病毒 核內(nèi)（除痘病毒） RNA病毒 胞質(zhì)（除流感病毒及逆轉(zhuǎn)錄病

8、毒）,生物合成（以dsDNA為例）,親代DNA mRNA 早期蛋白（酶） （功能蛋白）子代DNA 子代mRNA 晚期蛋白 （結(jié)構(gòu)蛋白）

9、 子代病毒,,,,,,,,RNA病毒的生物合成,單正鏈RNA =mRNA 結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白中間復(fù)制體 子代核酸單負(fù)鏈RNA 正鏈 RNA 蛋白質(zhì)中間復(fù)制體 子代核酸（依賴RNA的RNA多聚酶）,,,,,,,,逆轉(zhuǎn)錄病毒,病毒RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 RNA:DNA中間體

10、 雙鏈DNA 整合入細(xì)胞染色體 子代病毒mRNA和子代核酸,,,,,5-7. assembly，maturation, and release,裝配（assembly）,釋放（release）,裂解（Disintegration） : naked virus cause the host cell lysis出芽（Budding）: enveloped viruses,二、病毒的

11、生長曲線,1、隱蔽期2、對數(shù)生長期3、細(xì)胞死亡期,缺陷病毒 因病毒基因組不完整或基因發(fā)生改變，而不能進(jìn)行正常增殖所 產(chǎn)生的子代病毒。缺陷干擾顆粒(defective interfering particle, DIP)：缺陷病毒，具有干擾同種成熟病毒體進(jìn)入細(xì)胞的作用。輔助病毒 可以輔助缺陷病毒完成正常增殖的病毒。,三、與病毒增殖有關(guān)的異?，F(xiàn)象,,頓挫感染 病毒進(jìn)入宿主細(xì)

12、胞后，如細(xì)胞不能為病毒增殖提供所需要的酶、能量及必要的成分，則病毒在細(xì)胞中不能合成本身的成分，稱為頓挫感染。非容納細(xì)胞、容納細(xì)胞。干擾現(xiàn)象 兩種病毒感染同一種細(xì)胞，常發(fā)生一種病毒抑制另一種病毒復(fù)制的現(xiàn)象，稱干擾現(xiàn)象。機(jī)制：IFN、受體、DIP。,第三節(jié) 理化因素對病毒的影響,一、物理因素的影響溫度大多數(shù)病毒耐冷不耐熱。在－70℃（數(shù)月）或－196℃（數(shù)年）條件下，病毒感染性可保持?jǐn)?shù)月至數(shù)年。一般加熱60℃經(jīng)30mi

13、n或100℃數(shù)秒鐘可使大多數(shù)病毒滅活。pH值多數(shù)病毒在pH6～8范圍內(nèi)穩(wěn)定。射線和UV射線使核苷酸鏈發(fā)生致死性斷裂；UV則是在病毒的多核苷酸上形成雙聚體 (如胸腺核苷與尿核苷)，抑制病毒DNA或RNA的復(fù)制。,二、化學(xué)因素的影響脂溶劑乙醚、氯仿、去氧膽酸鹽等脂溶劑可使有包膜病毒的包膜脂質(zhì)溶解而滅活病毒，失去吸附能力。 消毒劑過氧乙酸、甲醛等均能使大多數(shù)病毒滅活。與細(xì)菌相比，病毒對消毒劑抵抗力強(qiáng)，特別是無包膜的小型病毒。

14、中草藥板藍(lán)根、大青葉、大黃、貫仲和七葉一枝花等對某些病毒有一定的抑制作用。,第四節(jié) 病毒分類—動物病毒,DNA病毒,RNA病毒,亞病毒：一類比病毒還小的、結(jié)構(gòu)更簡單的微生物。包括類病毒和Prion。,病毒的感染與致病機(jī)制,,第一節(jié) 病毒的傳播方式和感染類型,,一、病毒感染,來源感染途徑傳播方式水平傳播垂直傳播,二、病毒感染的類型,機(jī)體感染病毒后 1.按有無臨床癥狀，可分為隱性感染和顯性感染。 2.依病毒感染后在機(jī)

15、體內(nèi)滯留的時間長短，分為急性感染和持續(xù)性感染。 3.持續(xù)性感染根據(jù)發(fā)展和預(yù)后又分為慢性感染、潛伏感染、慢發(fā)病毒感染和急性感染的遲發(fā)并發(fā)癥。,（一）隱性病毒感染與顯性病毒感染,1.隱性病毒感染 病毒進(jìn)入機(jī)體后不引起臨床癥狀的感染，對組織和細(xì)胞的損傷不明顯。 相關(guān)因素：病毒毒力弱、機(jī)體防御能力強(qiáng)、病毒種類、病毒的性質(zhì)。 病毒仍可在體內(nèi)增殖并向外界播散病毒，可成為重要的傳染源。隱性感染者雖不出現(xiàn)臨床癥狀，但仍可獲得免

16、疫力而終止感染。 病毒攜帶者：有部分隱性感染者一直不產(chǎn)生對此種病毒的免疫力叫病毒攜帶者，無癥狀，但病毒可在體內(nèi)增殖并向外界排泄播散，也是重要的傳染源。,有的病毒如天花病毒、麻疹病毒等進(jìn)入機(jī)體，到達(dá)靶細(xì)胞后大量增殖，使細(xì)胞和組織損傷，機(jī)體出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，這樣的感染稱為顯性病毒感染或臨床感染；按癥狀出現(xiàn)早晚、持續(xù)時間的長短以及病毒在體內(nèi)持續(xù)存在狀態(tài)等顯性感染又分為急性病毒感染和持續(xù)性病毒感染兩種。,2.顯性病毒感染,（二）急性(病原

17、消滅型)病毒感染,病毒侵入機(jī)體后，在細(xì)胞內(nèi)增殖，經(jīng)數(shù)日以至數(shù)周的潛伏期后突然發(fā)病。 在潛伏期內(nèi)：1、病毒增殖到一定水平，由靶細(xì)胞的損傷和死亡而導(dǎo)致組織器官的損傷和功能障礙，出現(xiàn)臨床癥狀。2、宿主動員非特異性和特異性免疫因素清除病毒。 宿主一般能在癥狀出現(xiàn)一段時間內(nèi)，把病毒清除掉而進(jìn)入恢復(fù)期。 特點：為潛伏期短，發(fā)病急，病程數(shù)日至數(shù)周。病后常獲得特異性免疫。因此，特異性抗體可作為受過感染的證據(jù)。,（三）持續(xù)性病毒感染,病毒可在

18、機(jī)體內(nèi)持續(xù)存在數(shù)月數(shù)年數(shù)十年。可出現(xiàn)癥狀，可不出現(xiàn)癥狀而長期帶病毒，成為重要的傳染源。 持續(xù)性病毒感染有病毒和機(jī)體兩方面的因素： 機(jī)體免疫功能低下，無力完全清除病毒；病毒抗原性弱，機(jī)體難以產(chǎn)生免疫應(yīng)答以清除； 病毒存在于受保護(hù)的部位或病毒發(fā)生突變,可以逃避宿主免疫作用； 某些病毒的抗原性弱，難以產(chǎn)生免疫應(yīng)答； 病毒基因整合在宿主細(xì)胞的基因組中，長期與宿主細(xì)胞共存。,持續(xù)性感染有下述四種類型：,1．潛伏性病毒感染( late

19、nt viral infection) 2．慢性病毒感染（chronic viral infection） 3．慢發(fā)病毒感染(slow virus infection)或稱遲發(fā)病毒感染(delayed viral infection) 4．急性病毒感染的遲發(fā)并發(fā)癥（delayed complication after acute viral infection）,1. 潛伏性病毒感染,經(jīng)急性或隱性感染后，病毒基因組存在于一定組織或

20、細(xì)胞內(nèi)，但并不能產(chǎn)生有感染性的病毒體。在某些條件下病毒被激活而急性發(fā)作，病毒僅在臨床出現(xiàn)間歇性急性發(fā)作時才被檢出。在非發(fā)作期，用一般常規(guī)法不能分離出病毒。 例如，單純皰疹病毒Ⅰ型（HSV-1）感染 水痘帶狀皰疹病毒（VZV）感染,2. 慢性病毒感染,經(jīng)顯性或隱性感染后，病毒并未完全清除，可持續(xù)存在于血液或組織中并不斷排出體外，病程長達(dá)數(shù)月至數(shù)十年?；颊呖杀憩F(xiàn)輕微或無臨床癥狀。如乙型肝炎病毒（HBV）、巨細(xì)胞病毒（

21、CMV）及EB病毒（EBV）等常形成慢性感染。,3.慢發(fā)病毒感染,病毒感染后潛伏期很長可達(dá)數(shù)月、數(shù)年甚至數(shù)十年之久。此時機(jī)體無癥狀，也分離不出病毒。一旦發(fā)病出現(xiàn)慢性進(jìn)行性疾病，最終常為致死性感染。 如：AIDS、羊瘙癢?。╯crapie）、人克雅?。–JD） 、庫魯病（Kuru）等。庫魯病是朊病毒感染機(jī)體后，經(jīng)過長達(dá)數(shù)十年的潛伏期后，引起的一種進(jìn)行性小腦退行性疾病。,4.急性病毒感染的遲發(fā)并發(fā)癥,急性感染后1年或數(shù)年，發(fā)生致死性的病

22、毒病。 如亞急性硬化性全腦炎（SSPE）。該病是在兒童期感染麻疹病毒后，有些到青春期才表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，用電鏡在腦組織中可查到類似麻疹病毒樣顆粒。有人認(rèn)為這是麻疹病毒的缺陷病毒。,第二節(jié) 病毒的致病機(jī)制,病毒能否感染機(jī)體引起疾病取決于病毒的致病性 病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖，導(dǎo)致宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變，并擴(kuò)延到多數(shù)細(xì)胞，便可形成組織器官的損傷及功能障礙。宿主免疫力 在病毒和機(jī)體細(xì)胞相互作用過程中，機(jī)體的免疫應(yīng)答有時也可對

23、機(jī)體造成某些免疫病理性損傷，介導(dǎo)疾病的發(fā)生與發(fā)展。,一、病毒感染引起宿主細(xì)胞的變化,病毒對細(xì)胞的致病作用包括來自病毒的直接損傷和機(jī)體免疫病理應(yīng)答兩個方面。敏感的宿主細(xì)胞被病毒感染后，兩者相互作用下可表現(xiàn)為： 溶細(xì)胞作用 穩(wěn)定狀態(tài)感染 細(xì)胞凋亡 包涵體的形成 細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)化 病毒基因的整合,（一）溶細(xì)胞作用,病毒在宿主易感細(xì)胞內(nèi)增殖成熟后，短時間釋放大量子代病毒造成細(xì)胞破壞與死亡，這種作用稱殺細(xì)胞效應(yīng)，或稱為溶細(xì)胞作用。主要見

24、于無包膜，殺傷性強(qiáng)的病毒。 病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖引起細(xì)胞變性、死亡裂解的作用稱病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect, CPE）。,,病毒培養(yǎng)時出現(xiàn)的CPE,(二)穩(wěn)定狀態(tài)感染,一些不具有殺細(xì)胞效應(yīng)的病毒（多為有包膜病毒）所引起的感染稱穩(wěn)定狀態(tài)感染(steadystate infection)。 病毒在感染宿主細(xì)胞的過程中，對細(xì)胞代謝、溶酶體膜影響不很大。成熟的病毒多以出芽方式釋放出來，其過程緩慢、病變輕微，細(xì)胞暫時

25、還不會出現(xiàn)裂解和死亡，但可發(fā)生宿主細(xì)胞膜受體被破壞、細(xì)胞膜成分發(fā)生變化，出現(xiàn)細(xì)胞融合及細(xì)胞表面產(chǎn)生新的抗原等。,1.細(xì)胞融合：感染與未感染的細(xì)胞融合，可以使病毒從感染的細(xì)胞直接進(jìn)入相鄰的正常細(xì)胞，有利于病毒在細(xì)胞間的擴(kuò)散。 2.細(xì)胞膜出現(xiàn)新抗原：病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖過程中，將病毒基因編碼的蛋白質(zhì)插入細(xì)胞膜表面，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面抗原的改變。 有利于進(jìn)行病毒感染的診斷。,（三）細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡（cell apoptosis）是由細(xì)胞基因自身指

26、令發(fā)生的一種生物學(xué)過程。實驗研究證實有些病毒（腺病毒、人免疫缺陷病毒等）增殖可直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可通過病毒基因組編碼的蛋白質(zhì)間接作用下誘發(fā)細(xì)胞凋亡。,（四）包涵體的形成,某些受病毒感染的細(xì)胞內(nèi)，用普通光學(xué)顯微鏡可看到有與正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)和著色不同的圓形或橢圓形斑塊，稱為包涵體（inclusion body or ibclusion）。因病毒種類不同，包涵體有位于胞漿內(nèi)的(痘病毒)，也有在細(xì)胞核內(nèi)的(皰疹病毒)；或者兩者都有(麻疹病毒)；

27、有嗜酸性的或嗜堿性的。包涵體的本質(zhì)：①有些病毒的包涵體就是病毒顆粒的聚集體；②有些是病毒增殖留下的痕跡；③病毒感染引起的細(xì)胞反應(yīng)物?？勺鳛樵\斷依據(jù)和鑒定病毒的參考。如從可疑為狂犬病的腦組織切片或涂片中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有嗜酸性包涵體，即內(nèi)基小體(Negri body)，可診斷為狂犬病。,（五）細(xì)胞轉(zhuǎn)化增生和病毒基因組的整合,某些DNA病毒的全部或部分核酸，或RNA病毒基因組經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的DNA，結(jié)合至細(xì)胞染色體中，稱為整合。整合作用可使細(xì)

28、胞遺傳性狀發(fā)生改變，即轉(zhuǎn)化（transformation）。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長、分裂失控，細(xì)胞可發(fā)生惡性變。,病毒的致腫瘤作用,DNA病毒： （1）乙型肝炎病毒（HBV）與原發(fā)性肝癌有關(guān)； （2）EB病毒（EBV）與鼻咽癌、非洲兒童惡性淋巴瘤有關(guān)； （3）人乳頭瘤病毒（HPV）與子宮頸癌有關(guān)。RNA病毒： 只有逆轉(zhuǎn)錄病毒科與癌癥有關(guān)。 人類T細(xì)胞白血病病毒(HTLV-I型)。,二、病毒感染引起的機(jī)體變化,(一)組織器

29、官的損傷及組織器官的親嗜性 病毒對細(xì)胞的殺傷作用，在大多數(shù)情況下，必然導(dǎo)致組織和器官的損傷和功能障礙。病毒對人體組織的致病作用是有選擇性的。例如，流感病毒和鼻病毒對呼吸道粘膜有親嗜性；天花病毒和皰疹病毒對皮膚粘膜細(xì)胞有親嗜性；而腦炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒則對神經(jīng)組織具有親嗜性。,（二)免疫病理損傷,1．體液免疫病理作用 許多病毒如狂犬病病毒、HSV、流感病毒等有包膜病毒侵入細(xì)胞后，能誘發(fā)細(xì)胞表面出現(xiàn)新抗原。這種抗原與特異性

30、抗體結(jié)合后，在補(bǔ)體參與下引起細(xì)胞的破壞。2．細(xì)胞免疫病理作用 細(xì)胞免疫在某些病毒感染的恢復(fù)上起著重要作用。但特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)可以同時損傷受病毒感染而出現(xiàn)膜新抗原的靶細(xì)胞。病毒蛋白亦可因與宿主細(xì)胞的某些蛋白間存在共同抗原性而導(dǎo)致自身免疫應(yīng)答。 由于某些病毒可引起免疫病理性損傷，因此，一般在臨床上不宜應(yīng)用免疫功能增強(qiáng)劑治療這類疾病。 綜上，病毒感染早期所致細(xì)胞損傷主要是病毒引起， 感染后期由免疫復(fù)合物、補(bǔ)體活化、A

31、DCC作用、CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的復(fù)雜反應(yīng)引起機(jī)體局部組織器官的嚴(yán)重?fù)p傷和炎癥。,(三)病毒感染對免疫系統(tǒng)的影響,1．病毒感染引起的免疫抑制 許多病毒感染可引起暫時性免疫抑制。如麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、CMV等感染，急性期和恢復(fù)期患者外周血淋巴細(xì)胞對特異性抗原和促有絲分裂原(PHA、ConA）的反應(yīng)減弱。同時，對結(jié)核菌素皮膚試驗也出現(xiàn)轉(zhuǎn)陰的情況。2．病毒感染對免疫活性細(xì)胞的殺傷 已發(fā)現(xiàn)引起AIDS的人類免疫缺陷病毒(HIV）對輔助性T細(xì)

32、胞(CD4＋)具有強(qiáng)親和性和殺傷性。因而在感染者出現(xiàn)CD4＋細(xì)胞減少，CD8+細(xì)胞數(shù)相對增多，兩種細(xì)胞比值倒置的現(xiàn)象。3．病毒感染引起自身免疫性疾病 隱蔽在細(xì)胞內(nèi)的一些抗原暴露或釋放出來；病毒抗原也可能與機(jī)體細(xì)胞結(jié)合，改變細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)成為“非已物質(zhì)”，這些細(xì)胞可成為靶細(xì)胞而受到免疫細(xì)胞和免疫因子的作用，從而發(fā)生自身免疫性疾病。,第三節(jié) 抗病毒免疫Antiviral Immunity,干擾素,定 義：,由病毒或其他干擾素誘生劑刺激

33、人或動物細(xì)胞所產(chǎn)生的一類分泌性蛋白具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。,,種 類：,種類產(chǎn)生細(xì)胞 抗病毒 免疫調(diào)節(jié) 抗腫瘤 ?人白細(xì)胞 強(qiáng) 弱 弱 ?人成纖維細(xì)胞 強(qiáng) 弱 弱 ?T細(xì)胞 弱 強(qiáng) 強(qiáng),抗病毒意

34、義：,抗病毒特點,種的特異性、間接性、廣譜性,早期中斷病毒復(fù)制，阻止病毒擴(kuò)散,Lysis of virus-infected cells by cytotoxic effector cells,體液免疫,病毒中和抗體：針對病毒某些表面抗原血凝抑制抗體：血凝素補(bǔ)體結(jié)合抗體：病毒內(nèi)部抗原或表面非中 和抗原,Humoral Immunity,Mechanisms of virus n

35、eutralization by antibody at the cellular level,Extracellular neutralization of virus by antibody,Antibody dependent cellular cytotoxicity or ADCC,細(xì)胞免疫,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞直接殺傷靶細(xì)胞（細(xì)胞裂解、細(xì)胞凋亡）分泌多種細(xì)胞因子（IFN－gamma、TNF）等發(fā)揮抗病毒作用。Th1細(xì)胞,

36、Lysis of virus-infected cells by cytotoxic effector cells,Cell-mediated events in viral infections,抗病毒免疫持續(xù)時間,牢固持久免疫力有病毒血癥的全身性病毒感染：水痘、天花單一血清型的病毒感染：乙型腦炎病毒短暫免疫力局部或粘膜表面感染：流感病毒、鼻病毒多血清型病毒感染：鼻病毒易發(fā)生抗原變異的病毒感染：流感病毒,病毒感染的診斷與防

37、治,常用的病毒學(xué)診斷方法包括：病毒的分離鑒定病毒的血清學(xué)檢查病毒蛋白和核酸的檢測,一、病毒感染的診斷,（一）標(biāo)本的采取與送檢,應(yīng)注意下列原則：1.對本身帶有雜菌 (如咽拭子、糞便) 或易受污染的標(biāo)本，要進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時，應(yīng)使用抗生素。 2.因病毒在室溫中易失去活性，標(biāo)本應(yīng)低溫保存并盡快送檢。 3.血清學(xué)診斷標(biāo)本的采取應(yīng)在發(fā)病初期和病后2～3w內(nèi)各取1份血清，以便對比雙份血清抗體效價的動態(tài)變化。,（二）病毒的分離與鑒定,病毒

38、的分離 1.動物接種 是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜 神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。,,2.雞胚培養(yǎng) 雞胚對多種病毒敏感。一般采用孵化9～14天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標(biāo)本 接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。,3.組織培養(yǎng)法 (tissueculture) 或

39、細(xì)胞培養(yǎng) (cellculture)法 是將離體活組織塊或分散的組織細(xì)胞加以培養(yǎng)的技術(shù)總稱，為病毒分離鑒定中的最常用的基本方法。,細(xì)胞的變化有些病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖時可引起特有的細(xì)胞病變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng) (cytopathic effect，CPE)。常見的變化有細(xì)胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等 作用于細(xì)胞膜，可使鄰近的細(xì)胞相互融合，形成多核巨細(xì)胞或稱融合細(xì)胞。 有些病毒 (如狂犬

40、病病毒、麻疹病毒等) 可在培養(yǎng)細(xì)胞中形成胞漿或核內(nèi)的包涵體。,病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指標(biāo),,病毒培養(yǎng)時出現(xiàn)的CPE,,2.紅細(xì)胞吸附 (hemadsorption,HAd) 流感或副流感病毒等感染細(xì)胞后，由于細(xì)胞膜上出現(xiàn)了血凝素(haemagglutinin,HA)，具有吸附脊椎動物 (豚鼠、雞、猴等) 紅細(xì)胞的能力，這一現(xiàn)象稱紅細(xì)胞吸附，常用來測定具有HA的粘病毒與副粘病毒的增殖。若有相應(yīng)的抗血清，則能中和細(xì)胞膜上的HA

41、，HAd不再發(fā)生，稱紅細(xì)胞吸附抑制試驗。,3.干擾現(xiàn)象(interference) 某些病毒感染細(xì)胞時不出現(xiàn)CPE或其他易于測出的變化(如HAd)，但能干擾在其后感染的另一病毒的增殖。如風(fēng)疹病毒感染Vero細(xì)胞時CPE不明顯，但它能干擾后感染的?？刹《?(ECHOV) 的增殖，從而阻抑后者所特有的CPE。,4.細(xì)胞代謝的改變 病毒感染細(xì)胞的結(jié)果可使培養(yǎng)液的pH值改變，說明細(xì)胞的代謝在病毒感染后發(fā)生了變化。這種培養(yǎng)環(huán)境的

42、生化改變也可作為判斷病毒增殖的指標(biāo)。,病毒的數(shù)量與感染性測定,空斑形成單位（Plaque Forming Unit，PFU）限于用在有產(chǎn)生空斑能力的病毒。測定單層細(xì)胞培養(yǎng)中病毒裂解空斑的形成。50%組織細(xì)胞感染量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）引起50%雞胚、動物死亡或50%的培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生CPE的最小病毒量。,（三）病毒感染的血清學(xué)診斷,原理是用已知病毒抗原來檢測病人血清中有

43、無相應(yīng)抗體，故須待病人感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時才能檢出。 另外，在采取臨床標(biāo)本及病人血清應(yīng)注意病程，必須采取患者急性期血清與恢復(fù)期血清 (雙份血清) 進(jìn)行血清學(xué)試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時，才有診斷意義。,（四）病毒感染的快速診斷,快速診斷主要是指從含有病毒標(biāo)本及感染機(jī)體的血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數(shù)小時內(nèi)即可得出結(jié)果。,形態(tài)學(xué)檢查,1.電鏡和免疫電鏡檢查 2.普通光學(xué)顯微

44、鏡檢查 有些病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖后，在細(xì)胞的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有) 出現(xiàn)一個或數(shù)個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性的結(jié)構(gòu)，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。,病毒蛋白抗原檢查,用熒光素、放射性同位素、過氧化物酶等標(biāo)記抗體，采用免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，檢測標(biāo)本中的病毒蛋白抗原，具有敏感、特異、快速等優(yōu)點。1.免疫熒光技術(shù) (immunofluorescence,IF) 2.固相放射免疫測定 (solid-

45、phase radioimmunoassay,SPRIA) 3.酶免疫技術(shù) (enzyme immunoassay,EIA)此法可檢測多種病毒及其抗體，主要是酶免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)。,特異性IgM抗體的檢測,檢測病毒特異性IgM抗體可診斷急性感染，特別是對證實孕婦感染風(fēng)疹病毒尤為重要，但應(yīng)注意類風(fēng)濕因子 (IgM) 的干擾。另外，檢測早期抗原的抗體是快速診斷的另一途徑。如檢測針對EBV的早期抗原(EA)、核心抗

46、原 (EANA) 和衣殼抗原 (VCA) 等的抗體，可以區(qū)別急性或慢性EBV感染。此外，分子生物學(xué)檢測技術(shù)、氣相色譜技術(shù)等，均可用來分析和鑒定病毒感染。,檢測病毒核酸,1.核酸雜交技術(shù) 用于病毒檢測的有斑點雜交、細(xì)胞內(nèi)原位雜交 、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。2.核酸擴(kuò)增法 目前多數(shù)病毒基因已通過分子克隆技術(shù)被明確了核苷酸序列，使得DNA擴(kuò)增技術(shù)逐步發(fā)展為常規(guī)診斷技術(shù)之一。3.基因芯片技術(shù),,,病毒的快速診斷,光鏡-----包

47、涵體,電鏡,免疫熒光,ELISA,分子生物學(xué)技術(shù),雜交,Southern blot,PCR,Northern blot,,,,,,,,,,,,,,,二、 病毒感染的防治,免疫預(yù)防,人工主動免疫,滅活疫苗：,乙腦疫苗,狂犬疫苗,流感滅活疫苗,HAV等,減毒活疫苗：,脊髓灰質(zhì)炎疫苗,麻疹疫苗,腮腺炎疫苗,風(fēng)疹疫苗,HAV疫苗,其他疫苗：基因工程疫苗，核酸疫苗 ，亞單位疫苗等,,,,,藥物防治,金剛烷胺-------抑制病毒脫殼-----預(yù)