蘇云金芽孢桿菌菌株的分離鑒定及殺蟲基因的克隆.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一種可以形成芽孢的革蘭氏陽性菌，目前已成為產(chǎn)量最大、應(yīng)用面積最廣的微生物殺蟲劑。隨著Bt制劑的深入應(yīng)用，出現(xiàn)了害蟲抗性及殺蟲圖譜窄等問題，因此篩選新的Bt基因和發(fā)掘已知基因的新活性具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 本研究從河北省五岳寨地區(qū)采集了756份土壤樣品，采集對象為地表以下5公分的腐殖土，通過溫度篩選法分離得到72株Bt菌株。光學(xué)顯微鏡下觀測菌株的晶體形態(tài)發(fā)現(xiàn)伴

2、孢晶體包括了圓形、菱形、橢圓形、方形、不規(guī)則形等多種形態(tài)，充分體現(xiàn)五岳寨地區(qū)蘇云金芽孢桿菌資源豐富并具有良好的多態(tài)性。
　　 通過PCR-RFLP鑒定體系對分離得到的72株菌株進(jìn)行鑒定，利用26對通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定基因型。結(jié)果表明，從這些菌株中發(fā)現(xiàn)13種不同的基因型和9種基因組合，其中基因型包括cry1類，cry2類，cry3類，cry4類，cry6類，cry8類，cry9類，cry11I類，cry18類，cry22類，

3、cry26類，cry32類和cry11類，其中所占比例最大的是含有cry8類基因的菌株，為38株，其次為含cry1類和cry2類基因型的菌株，分別為30株和14株，另有10株未鑒定出基因型，可能含有新基因，需要借助其他方法進(jìn)一步確定。
　　 SDS-PAGE蛋白分析結(jié)果表明，大部分菌株均會表達(dá)130kDa、90kDa、60kDa大小的蛋白。其中含有cry1+cry2基因組合的菌株大多表達(dá)130kDa和60kDa大小的蛋白，僅包含

4、cry1或cry2類基因的菌株大多只表達(dá)130kDa大小的蛋白，其晶體形態(tài)多為菱形;僅包含cry8類基因的菌株多數(shù)只表達(dá)130kDa大小的蛋白，其晶體形態(tài)多為圓形或橢圓形;同時含有cry3+cry8類基因組合的菌會表達(dá)130kDa大小的蛋白;含有cry22類基因的菌株表達(dá)約90kDa大小的蛋白，其晶體形態(tài)為圓形;而未鑒定出基因類型的菌株其蛋白大小表達(dá)多樣。
　　 在對榆蘭葉甲幼蟲的生物活性測定中，菌株WYZ-54表現(xiàn)出了較強(qiáng)的活

5、性，其4d的校正死亡率達(dá)到80％，但是只表現(xiàn)出cry1、cry2和cry1I三類基因型，并未出現(xiàn)對鞘翅目具有活性的cry3或cry8類基因，通過克隆得到1500bp左右的部分基因序列，通過NCBIBlast分析，與GenBank中已知的Bt基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示菌株WYZ-54克隆的部分基因序列與GenBank中的已知模式基因Cry1Ia-likeprotein(cry1Ia)gene（序列號:FJ617448.1）的相似性最高，為

6、99％。
　　 FPT-25為實驗室保留菌株，在對暗黑鰓金龜幼蟲的生物活性測定中表現(xiàn)出較高活性，其14天校正死亡率達(dá)70％。經(jīng)PCR鑒定但未能確定其基因型，通過SDS-PAGE蛋白電泳分析，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)80kDa和50kDa兩條條帶的蛋白，而并未表達(dá)一般對鞘翅目昆蟲具有活性的130kDa的蛋白。根據(jù)Beron的研究方法，使用3對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收得到1900bp左右的基因片段，通過序列比對，未發(fā)現(xiàn)與GenBank中已知的

7、Bt基因存在相似性，推測含有新型基因，有待進(jìn)一步研究。
　　 對72株Bt菌株的生物活性測定選取小菜蛾、斜紋夜蛾、華北大黑鰓金龜和銅綠麗金龜幼蟲四種供試?yán)ハx。結(jié)果顯示，對小菜蛾具有較高毒力的Bt菌株(4d校正死亡率≥90％)有11株，其中校正死亡率達(dá)到100％有9株;對斜紋夜蛾具有較高毒力的Bt菌株（4d校正死亡率≥90％）有13株，其中校正死亡率達(dá)到100％的有12株;有7株菌株對銅綠麗金龜幼蟲具有較高殺蟲活性（14d校正死亡