鐮形扇頭蜱P0基因的克隆及其雙鏈RNA(dsRNA)殺蜱效果的研究.pdf

1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：刪 時間：勘廠廠年多 月沙日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的說明本人完全了解新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定

2、，即：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文檔，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以公布( 包括刊登) 論文的全部或部分內(nèi)容。( 保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名： 蝴導(dǎo)師簽名：時網(wǎng)：勘l j 年{ 只l 7 日時閫：h 燈年6 只《，日鐮形扇頭蜱P 0 基因的克隆及其雙鏈R N A

3、 ( d s R N A )殺蜱效果的研究摘要蜱，作為專性體表寄生蟲，主要侵襲哺乳類、鳥類、爬行類以及兩棲類等，其危害不僅在于攝食人和宿主動物的血液，還可通過吸血傳播病毒、細(xì)菌和原蟲等病原，引起人和動物的發(fā)病。目前主要通過化學(xué)防治來進(jìn)行蜱的防控，但該方法會污染環(huán)境、危害食品安全等。新型防控方法，如疫苗和生物防治，都還未取得成功，因此急需研發(fā)其他新型防控蜱的技術(shù)。近年來，R N A i 已經(jīng)應(yīng)用于蜱、蚊子等各種動物的基因功能研究中。因此，

4、本研究在R N A i 的原理基礎(chǔ)上，選擇P 0 作為靶基因，對雙鏈R N A 作為潛在的殺蜱劑進(jìn)行探索。本研究通過3 ' R A C E 和5 ' R A C E 的方法從鐮形扇頭蜱中克隆了P 0 全長基因。將該基因的O R F克隆至p G E X ．4 T ．1 ，構(gòu)建P 0 ／p G E X ．4 T ．1 重組質(zhì)粒，使P 0 基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。P 0 重組蛋白免疫小鼠后，制備抗血清，進(jìn)行W e s t e

5、 r n b l o t 分析。結(jié)果顯示，P 0 基因全長序列為1 1 1 8b p ，具有一個編碼3 1 9 個氨基酸的開放閱讀框，推測P 0 的蛋白大小約為3 5 k u ，沒有信號肽序列。P 0 與其他蜱種具有很高的同源性，本研究獲得的P 0 基因與微小扇頭蜱、長角血蜱的該基因相似性分別為9 4 ％、，8 7 ％。原核表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白大小為6 0k u ，W e s t e m b l o t 分析顯示重組蛋白制備的小鼠血清

6、‘，可以識別鐮形扇頭蜱體內(nèi)的唾液腺蛋白。體外合成P 0 雙鏈R N A 和L u c i f e r a s e 雙鏈R N A 。將三種轉(zhuǎn)染試劑L i p o f e c t a m i n e 2 0 0 0 、C e l l f e c t i nI I和D M R I E ．C 與雙鏈R N A 混合后浸染鐮形扇頭蜱的各個發(fā)育階段優(yōu)化最佳轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染試劑與雙鏈R N A 的最佳混合比例以及最佳浸染時間。將優(yōu)化的最佳條件浸染各個

7、發(fā)育階段的蜱之后，觀察生物學(xué)特性。結(jié)果顯示：對成蜱、若蜱和幼蜱，最佳轉(zhuǎn)染試劑均為D M R I E ．C ；針對成蜱和幼蜱，轉(zhuǎn)染試劑與雙鏈R N A 的最佳混合比例是l ：l ，而若蜱，兩者的最佳混合比例是l ：2 ；成蜱、若蜱的最佳浸染時間分別為1 2h 、6h ，而幼蜱的最佳浸染時間則是2 4h 。殺蜱試驗表明蜱體內(nèi)的P 0 基因被沉默后，會影響蜱吸血的相關(guān)生物學(xué)特性，比如：降低2 4 h 吸附率、降低平均飽血體重、延長平均飽血時間