新孢子蟲P0基因的真核表達及DNA疫苗的初步研究.pdf

1、新孢子蟲病(Neosporosis)是由犬新孢子蟲(Neospora caninum)引起的一種世界范圍流行、多種動物共患的原蟲病，主要引發(fā)犬神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病及牛嚴重的繁殖障礙性疫病，孕牛頻發(fā)流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱胎等一系列臨床癥狀，該病給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前，還沒有防制新孢子蟲病的有效措施，一般認為疫苗免疫是預防牛流產(chǎn)和降低經(jīng)濟損失的可行性措施，因此，開發(fā)新疫苗已成為該領(lǐng)域研究熱點。
　　新孢子蟲核糖體磷蛋白P0(Ribos

2、omal phosphoprotein P0，NcP0)可作為新孢子蟲和剛地弓形蟲之間的交叉反應性抗原，其抗體可抑制這兩種蟲體的生長。本試驗采用PCR技術(shù)擴增出P0蛋白全長基因序列，并將其克隆入真核表達載體pVAX1中，構(gòu)建pVAX1-NcP0表達質(zhì)粒，分別進行PCR、雙酶切及測序鑒定。用脂質(zhì)體法將陽性克隆瞬時轉(zhuǎn)染vero細胞，對轉(zhuǎn)染細胞進行RT-PCR檢測和IFA檢測目的基因的轉(zhuǎn)錄與表達情況。結(jié)果表明克隆的P0蛋白基因序列全長為137

3、9 bp，構(gòu)建的表達載體經(jīng)鑒定無誤。RT-PCR結(jié)果顯示目的基因已被成功轉(zhuǎn)錄。IFA檢測證明目的基因被成功表達。本試驗成功構(gòu)建了新孢子蟲核糖體磷蛋白(NcP0)的真核表達載體，轉(zhuǎn)染Vero細胞，獲得了新孢子蟲核糖體磷蛋白(NcP0)的瞬時表達。將大量提取并純化的pVAX1-NcP0質(zhì)粒添加佐劑免疫沙鼠，測定沙鼠的體液免疫和細胞免疫應答，以評價疫苗的免疫效果。
　　應用IFAT對免疫后沙鼠每周抗體效價進行測定，結(jié)果顯示，Cp-M佐劑

4、組、pVAX1-NcP0組的抗體效價均高于pVAX1空載體組和對照組，其中Cp-M組效價最高，攻毒后，Cp-M佐劑組、pVAX1-NcP0組比pVAX1空載體組和對照組抗體水平上升顯著，Cp-M佐劑組、pVAX1-NcP0組分別與pVAX1空載體組和對照組差異極顯著（P＜0.01）。
　　免疫沙鼠的細胞免疫測定分別采用檢測T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+百分含量及淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗進行評估。結(jié)果顯示疫苗Cp-M佐劑組、pVAX1-N

5、cP0組的CD4+細胞含量均高于pVAX1空載體組和對照組，Cp-M組、pVAX1-NcP0組與pVAX1空載體組和對照組均差異極顯著（P＜0.01），其中Cp-M佐劑組最高。
　　Cp-M組、pVAX1-NcP0組的CD8+細胞含量均高于pVAX1空載體組和對照組，Cp-M佐劑組與pVAX1空載體組和對照組差異顯著（P＜0.05），pVAX1-NcP0組與pVAX1空載體組差異不顯著。Cp-M組、pVAX1-NcP0組的CD4+

6、/CD8+值均高于pVAX1空載體組和對照組，Cp-M組、pVAX1-NcP0組與對照組差異顯著（P＜0.05），Cp-M組、pVAX1-NcP0組與pVAX1空載體組差異不顯著。Cp-M組、pVAX1-NcP0組的CD4+/CD8+值均高于pVAX1空載體組和對照組，Cp-M組、pVAX1-NcP0組與對照組差異顯著（P＜0.05），Cp-M組、pVAX1-NcP0組與pVAX1空載體組差異不顯著。攻毒試驗后經(jīng)計算得出疫苗保護率分別為