擬南芥STM、WUS和CLV3相互作用調(diào)控莖端分生組織干細(xì)胞活性的研究.pdf

1、莖端分生組織是植物莖、葉和花等地上部分器官發(fā)生的來(lái)源。莖端分生組織的組織中心和其上方的干細(xì)胞構(gòu)成的干細(xì)胞微環(huán)境是維持分生組織的基礎(chǔ)。WUSCHEL（WUS）編碼組織中心的關(guān)鍵調(diào)控因子，能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞特征基因CLAVATA3(CLV3)在組織中心上方的細(xì)胞中表達(dá)，并賦予它們干細(xì)胞的特征。盡管目前對(duì)WUS的功能有了一定的認(rèn)識(shí)，但是對(duì)于WUS如何調(diào)節(jié)干細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。本研究中我們篩選到多個(gè)擬南芥WUS互作蛋白，其中包括莖端分

2、生組織特異調(diào)控因子SHOOT MERISTEMLESS(STM)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WUS和STM發(fā)生直接的相互作用，并能共同結(jié)合CLV3基因的啟動(dòng)子以激活其表達(dá)，從而調(diào)控莖端分生組織干細(xì)胞的活性。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)STM蛋白與WUS蛋白之間存在直接的相互作用
　　為了進(jìn)一步揭示W(wǎng)US蛋白在調(diào)控莖端分生組織發(fā)育過(guò)程中的分子機(jī)理，我們利用免疫共沉淀聯(lián)合蛋白質(zhì)譜技術(shù)，尋找WUS蛋白在調(diào)控莖端分生組織發(fā)育過(guò)程中

3、的互作因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SHOOT MERISTEMLESS(STM)蛋白與WUS蛋白在擬南芥體內(nèi)存在直接的相互作用。STM基因?qū)ηo端分生組織的建成與維持都具有非常重要的作用。我們利用Pull-Down、酵母雙雜交等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)兩者之間存在直接的相互作用。
　　(2)STM基因與WUS基因表達(dá)模式的分析
　　利用激光共聚焦顯微鏡對(duì)pSTM∷STM-VENUS與pWUS∷WUS-3 GFP轉(zhuǎn)基因植株中STM基因與WU基因的

4、表達(dá)模式進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)最早在16細(xì)胞胚時(shí)期檢測(cè)到了WUS蛋白的信號(hào)，而此時(shí)并未檢測(cè)到STM蛋白的出現(xiàn);而在三角形胚時(shí)期，心形胚時(shí)期，WUS蛋白與STM蛋白的信號(hào)都是共定位的;在幼苗期及生殖發(fā)育階段，整個(gè)莖端分生組織充滿了STM蛋白的信號(hào)，而WUS蛋白的信號(hào)集中在組織中心區(qū)域，包含在STM蛋白的表達(dá)范圍之內(nèi)。
　　(3)STM蛋白直接調(diào)控CLV3基因的表達(dá)
　　我們檢測(cè)了stm突變體與STM基因過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中CLV3基

5、因的表達(dá)量，RT-PCR結(jié)果顯示，與野生型相比，在stm突變體中CLV3基因的表達(dá)量明顯下降，而利用地塞米松誘導(dǎo)的35S∷STM-GR的轉(zhuǎn)基因植株中，CLV3的表達(dá)量顯著升高。
　　經(jīng)過(guò)分析啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，我們發(fā)現(xiàn)CLV3基因啟動(dòng)子區(qū)域存在STM蛋白特異結(jié)合的核心序列，STM蛋白能否直接調(diào)控CLV3基因的表達(dá)呢？染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)表明，在擬南芥植株體內(nèi)STM蛋白與CLV3基因之間存在著相互作用。經(jīng)過(guò)凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMS

6、A)進(jìn)一步驗(yàn)證，STM蛋白可以直接結(jié)合在CLV3基因的啟動(dòng)子上激活其表達(dá)。
　　(4)STM與WUS蛋白相互作用共同調(diào)控CLV3基因的表達(dá)
　　利用CLV3啟動(dòng)子啟動(dòng)CLV3基因全長(zhǎng)互補(bǔ)clv3-2突變體，恢復(fù)了野生型表型;而分別突變CLV3基因啟動(dòng)子上WUS蛋白或STM蛋白的結(jié)合位點(diǎn)之后啟動(dòng)CLV3基因全長(zhǎng)互補(bǔ)clv3-2突變體，均只能部分恢復(fù)突變體表型;當(dāng)同時(shí)突變CLV3基因啟動(dòng)子上WUS與STM蛋白的結(jié)合位點(diǎn)之后互補(bǔ)c

7、lv3-2突變體，突變體的表型則完全不能恢復(fù)。另外，將擬南芥植株中STM勺表達(dá)量下調(diào)之后，WUS蛋白對(duì)CLV3基因的結(jié)合能力明顯下降;同時(shí)，若將植株中WUS的表達(dá)量下調(diào)之后，STM蛋白對(duì)CLV3的結(jié)合能力也呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。
　　(5)CLV3與STM之間存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制
　　本實(shí)驗(yàn)中利用qRT-PCR對(duì)clv3突變體中STM因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在clv3突變體中STM基因的表達(dá)量與野生型相比有了顯著提高。原位雜交結(jié)

8、果顯示，clv3突變體中STM基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也有明顯的增加。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在莖端分生組織的發(fā)育過(guò)程中，CLV3基因會(huì)抑制ST基因的表達(dá)，從而在兩者之間形成了一個(gè)類似于CLV3-WUS之間的反饋調(diào)節(jié)環(huán)。
　　綜上所述，STM蛋白在調(diào)控莖端分生組織發(fā)育的過(guò)程中與WUS蛋白存在直接的相互作用，同時(shí)STM蛋白還能夠直接結(jié)合到CLV3基因的啟動(dòng)子上激活CLV3基因的表達(dá)。因此，STM與WUS蛋白可以相互作用共同調(diào)控CLV3基因的表達(dá)，當(dāng)