擬南芥中與藍光受體CRY2相互作用蛋白的生化分析.pdf

1、隱花色素CRY2(cryptochrome2)是植物感受藍光的光受體之一,它介導(dǎo)了藍光調(diào)節(jié)植物的光形態(tài)建成反應(yīng),如抑制下胚軸的伸長、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、激活基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)開花等。Cashmore等人1993年就確定CRY2是植物的藍光受體,但是直到現(xiàn)在,在藍光受體CRY2信號傳導(dǎo)方面的研究一直沒有重大突破；因此,首先有必要通過各種分子生物學(xué)與遺傳學(xué)的方法找到與藍光受體CRY2相互作用的蛋白,為進一步研究CRY2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑奠定基礎(chǔ)。

2、r>　　 本研究首先構(gòu)建了酵母雙雜交載體pBridge—CRY2,然后以pBridge-CRY2作為Bait對構(gòu)建在Prey載體PACT1中的酵母雙雜交文庫進行了篩選。通過篩選酵母雙雜交文庫發(fā)現(xiàn)藍光下CRY2可能與多種蛋白發(fā)生相互作用。其中包括生物鐘核心振蕩器組分蛋白LHY與CCA1,翻譯起始因子EIF4E,磷酸酶AT3G51370,以及激酶CKA2和CKI。
　　 本課題重點對CRY與生物鐘相關(guān)蛋白的相互作用進行了深入研究。

3、通過RT-PCR克隆了CKA2,LHY,CCA1基因,并成功構(gòu)建了pGADT7-CKA2,pGADT7-LHY,pGADT7-CCA1載體。我們通過營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)試驗,濾紙顯色反應(yīng)和液相顯色反應(yīng)檢測了在藍光和黑暗條件下pBridge-CRY2與pGADT7-CKA2,pGADT7-LHY,pGADT7-CCA1在酵母體內(nèi)的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):CRY2蛋白在藍光條件下與CKA2有較強的相互作用,而與LHY,CCA1的相互作用較弱,而且CR

4、Y2與CKA2,LHY,CCA1的相互作用強度與藍光光強呈正相關(guān)；而在黑暗條件下CRY2與所檢測蛋白均無相互作用。
　　 成功構(gòu)建了pColdTF-CKA2,pColdTF-LHY,pColdTF-CCA1原核表達載體,并采用大腸桿菌BL21表達得到了可溶的重組蛋白。然后,利用免疫共沉淀的方法檢測了CRY2蛋白與CKA2,LHY,CCA1蛋白之間的體外相互作用。結(jié)果表明擬南芥體內(nèi)的CRY2蛋白能夠與原核表達的重組蛋白CKA2,L

5、HY,CCA1在體外相互作用。
　　 采用裂解熒光素酶互補分析系統(tǒng)進一步研究了CRY2蛋白與CKA2,LHY,CCA1蛋白在植物細胞體內(nèi)的相互作用。實驗構(gòu)建了CRY2-NLUC質(zhì)粒,CKA2-CLUC質(zhì)粒,LHY-CLUC質(zhì)粒和CCA1-CLUC質(zhì)粒。試驗結(jié)果表明:CKA2與CRY2蛋白之間的相互作用較強,約為對照組CRY2與COP1蛋白之間作用強度的一半；而CRY2與LHY,CCA1的作用強度較弱,約為對照組CRY2與COP1