FBXO6相互作用糖蛋白的鑒定及其調控細胞周期的作用.pdf

1、SCF泛素E3連接酶復合體(SKP1-Cullinl-F-box E3 ligase complex)是一種由三個核心蛋白組成的蛋白質復合體,包括一個底物識別F-box蛋白,一個鉸鏈蛋白SKP1(S-phase kinase-associated protein1.)和能募集泛素結合酶E2的腳手架蛋白Cullinl(CUL1)。SCF泛素E3連接酶復合體通過F-box蛋白來識別和調控底物蛋白的穩(wěn)定性,在各種生物學活動中發(fā)揮了重要的作用。

2、SCF泛素E3連接酶是一個超家族,目前已經有70多個成員被報道。其中有一個亞家族由于含有FBA(F-box domain associate)結構域,因而能特異性識別糖蛋白。FBXO6為其家族成員之一。盡管FBXO6能識別糖蛋白,但是,具體FBXO6能識別哪些糖蛋白,其識別的糖蛋白是否都是其底物等等問題都暫不清楚。近年來,質譜技術在生命領域中的應用得到了迅猛的發(fā)展,利用質譜的高通量來系統(tǒng)性識別FBXO6的相互作用糖蛋白將有利于初步解決這

3、些重要的問題。
　　為了找到FBXO6的相互作用糖蛋白,我們分別在人宮頸癌細胞系HeLa、人胚腎細胞系293T和人淋巴細胞株瘤細胞Jurkat細胞中穩(wěn)定表達帶Flag標簽的FBXO6(Flag-FBXO6)。隨后利用Flag M2 beads在這些細胞系中進行了免疫沉淀實驗。免疫沉淀得到的蛋白經過SDS-PAGE分離后,考馬斯亮藍染色。差異條帶經割膠、酶解后由質譜鑒定。我們獲得了FBXO6在三種細胞系中的相互作用蛋白庫。經過比較這

4、些蛋白庫,我們一共獲得了39個在三種細胞系里都和FBXO6結合的蛋白,我們稱之為FBXO6相互作用核心蛋白,其中約有67％為糖蛋白。利用生物信息學(Gene Ontology)GO-分類研究,我們發(fā)現(xiàn)約有一半的蛋白為內質網蛋白。
　　之前的研究表明,FBXO6識別糖蛋白靠其FBA區(qū)域,而在其區(qū)域中的2個點突變后(241,242 YW-AA),能消除其糖蛋白識別功能(FBXO6Null)。為了進一步了解FBXO6與哪些糖蛋白結合,我

5、們在293T細胞里穩(wěn)定表達了Flag-FBXO6Null。我們進一步比較了FBXO6WT和FBXO6Null的蛋白復合體組成,發(fā)現(xiàn)有140個蛋白特異性的結合FBXO6WT而不與FBXO6Null相互作用,而在這些蛋白中糖蛋白的比例占到了66％。我們接著比較了FBXO6核心蛋白和FBXO6WT特異結合蛋白(而不與FBXO6Null結合)的組成,發(fā)現(xiàn)核心蛋白有30個蛋白能特異性與FBXO6WT結合,其中29個蛋白為糖蛋白。我們隨后用West

6、ern blot驗證了結合的特異性,其中4個糖蛋白都只能和FBXO6WT發(fā)生相互作用而不與FBXO6Null結合。
　　我們選取了一個糖蛋白ErolL為例,來研究FBXO6與這些糖蛋白的關系。我們發(fā)現(xiàn)ErolL特異性只和FBXO6結合,而不與其它9個F-box蛋白結合。利用糖苷酶Endo H和PNGase F,我們發(fā)現(xiàn)與FBXO6結合的ErolL都是糖基化形式。事先利用糖苷酶處理細胞裂解液后,FBXO6不能與非糖基化的ErolL發(fā)

7、生相互作用。衣霉素能抑制糖鏈的生成,穩(wěn)定表達Flag-FBXO6的293T細胞經過衣霉素處理后,ErolL出現(xiàn)了糖基化和非糖基化兩種形式,而只有糖基化形式能和FBXO6相互作用。
　　大量的研究顯示SCF連接酶復合體參與到了細胞周期的調控。SCF復合體能識別并降解許多關鍵的細胞周期蛋白,并驅動細胞周期的進展。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),一些F-box(如SKP2)蛋白本身也被細胞周期所調控,然而,迄今為止,大部分F-box蛋白的功能還不清

8、楚,是否有更多的新的F-box蛋白為細胞周期蛋白值得深入的研究。細胞周期由周期性的蛋白激酶以及周期蛋白調控,特別是在有絲分裂過程中,激酶的活性得到了大量的積累,為細胞分裂做好了準備。之前我們已經克隆了20多個N端帶Flag標簽的F-box蛋白,為了研究是否有新的F-box蛋白能受細胞周期調控,我們做了一個小規(guī)模的篩選,發(fā)現(xiàn)FBXO6在有絲分裂期能被特異性的磷酸化修飾。隨后,我們在A549細胞里面,用FBXO6抗體檢測內源性的FBXO6驗

9、證了該結果。的確,在我們之前的免疫沉淀質譜實驗中,我們發(fā)現(xiàn)了一個磷酸激酶CDK1能與FBXO6相互作用。僅過表達或者敲除FBXO6對HeLa細胞的周期沒有明顯的影響。但有趣的是,FBXO6能加快同步化的HeLa有絲分裂期(M期)到G1期的轉換。在同步化的細胞中,過表達FBXO6能突破有絲分裂檢查點的限制,迫使細胞強行分裂,最終導致基因組不穩(wěn)定性和細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn),FBXO6能特異性與有絲分裂檢查點蛋白Mad2(mitotic a

10、rrest deficient2)和BubRl(Mitotic checkpointserine/threonine-protein kinase BUB1 beta)相互作用,可能通過扣留或者抑制這些檢查點蛋白的活性來突破有絲分裂檢查點的屏障。
　　總之,我們成功的建立了一個蛋白質相互作用鑒定平臺。利用該平臺我們系統(tǒng)性的鑒定了FBXO6的相互作用蛋白和糖蛋白.我們發(fā)現(xiàn)FBXO6是一個細胞周期特異性磷酸化蛋白,對有絲分裂檢查點蛋白