FBXO6相互作用糖蛋白的鑒定及其調(diào)控細(xì)胞周期的作用.pdf

1、SCF泛素E3連接酶復(fù)合體(SKP1-Cullinl-F-box E3 ligase complex)是一種由三個核心蛋白組成的蛋白質(zhì)復(fù)合體,包括一個底物識別F-box蛋白,一個鉸鏈蛋白SKP1(S-phase kinase-associated protein1.)和能募集泛素結(jié)合酶E2的腳手架蛋白Cullinl(CUL1)。SCF泛素E3連接酶復(fù)合體通過F-box蛋白來識別和調(diào)控底物蛋白的穩(wěn)定性,在各種生物學(xué)活動中發(fā)揮了重要的作用。

2、SCF泛素E3連接酶是一個超家族,目前已經(jīng)有70多個成員被報道。其中有一個亞家族由于含有FBA(F-box domain associate)結(jié)構(gòu)域,因而能特異性識別糖蛋白。FBXO6為其家族成員之一。盡管FBXO6能識別糖蛋白,但是,具體FBXO6能識別哪些糖蛋白,其識別的糖蛋白是否都是其底物等等問題都暫不清楚。近年來,質(zhì)譜技術(shù)在生命領(lǐng)域中的應(yīng)用得到了迅猛的發(fā)展,利用質(zhì)譜的高通量來系統(tǒng)性識別FBXO6的相互作用糖蛋白將有利于初步解決這

3、些重要的問題。
　　為了找到FBXO6的相互作用糖蛋白,我們分別在人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、人胚腎細(xì)胞系293T和人淋巴細(xì)胞株瘤細(xì)胞Jurkat細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)帶Flag標(biāo)簽的FBXO6(Flag-FBXO6)。隨后利用Flag M2 beads在這些細(xì)胞系中進(jìn)行了免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。免疫沉淀得到的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE分離后,考馬斯亮藍(lán)染色。差異條帶經(jīng)割膠、酶解后由質(zhì)譜鑒定。我們獲得了FBXO6在三種細(xì)胞系中的相互作用蛋白庫。經(jīng)過比較這

4、些蛋白庫,我們一共獲得了39個在三種細(xì)胞系里都和FBXO6結(jié)合的蛋白,我們稱之為FBXO6相互作用核心蛋白,其中約有67％為糖蛋白。利用生物信息學(xué)(Gene Ontology)GO-分類研究,我們發(fā)現(xiàn)約有一半的蛋白為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白。
　　之前的研究表明,FBXO6識別糖蛋白靠其FBA區(qū)域,而在其區(qū)域中的2個點(diǎn)突變后(241,242 YW-AA),能消除其糖蛋白識別功能(FBXO6Null)。為了進(jìn)一步了解FBXO6與哪些糖蛋白結(jié)合,我

5、們在293T細(xì)胞里穩(wěn)定表達(dá)了Flag-FBXO6Null。我們進(jìn)一步比較了FBXO6WT和FBXO6Null的蛋白復(fù)合體組成,發(fā)現(xiàn)有140個蛋白特異性的結(jié)合FBXO6WT而不與FBXO6Null相互作用,而在這些蛋白中糖蛋白的比例占到了66％。我們接著比較了FBXO6核心蛋白和FBXO6WT特異結(jié)合蛋白(而不與FBXO6Null結(jié)合)的組成,發(fā)現(xiàn)核心蛋白有30個蛋白能特異性與FBXO6WT結(jié)合,其中29個蛋白為糖蛋白。我們隨后用West

6、ern blot驗(yàn)證了結(jié)合的特異性,其中4個糖蛋白都只能和FBXO6WT發(fā)生相互作用而不與FBXO6Null結(jié)合。
　　我們選取了一個糖蛋白ErolL為例,來研究FBXO6與這些糖蛋白的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)ErolL特異性只和FBXO6結(jié)合,而不與其它9個F-box蛋白結(jié)合。利用糖苷酶Endo H和PNGase F,我們發(fā)現(xiàn)與FBXO6結(jié)合的ErolL都是糖基化形式。事先利用糖苷酶處理細(xì)胞裂解液后,FBXO6不能與非糖基化的ErolL發(fā)

7、生相互作用。衣霉素能抑制糖鏈的生成,穩(wěn)定表達(dá)Flag-FBXO6的293T細(xì)胞經(jīng)過衣霉素處理后,ErolL出現(xiàn)了糖基化和非糖基化兩種形式,而只有糖基化形式能和FBXO6相互作用。
　　大量的研究顯示SCF連接酶復(fù)合體參與到了細(xì)胞周期的調(diào)控。SCF復(fù)合體能識別并降解許多關(guān)鍵的細(xì)胞周期蛋白,并驅(qū)動細(xì)胞周期的進(jìn)展。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),一些F-box(如SKP2)蛋白本身也被細(xì)胞周期所調(diào)控,然而,迄今為止,大部分F-box蛋白的功能還不清

8、楚,是否有更多的新的F-box蛋白為細(xì)胞周期蛋白值得深入的研究。細(xì)胞周期由周期性的蛋白激酶以及周期蛋白調(diào)控,特別是在有絲分裂過程中,激酶的活性得到了大量的積累,為細(xì)胞分裂做好了準(zhǔn)備。之前我們已經(jīng)克隆了20多個N端帶Flag標(biāo)簽的F-box蛋白,為了研究是否有新的F-box蛋白能受細(xì)胞周期調(diào)控,我們做了一個小規(guī)模的篩選,發(fā)現(xiàn)FBXO6在有絲分裂期能被特異性的磷酸化修飾。隨后,我們在A549細(xì)胞里面,用FBXO6抗體檢測內(nèi)源性的FBXO6驗(yàn)

9、證了該結(jié)果。的確,在我們之前的免疫沉淀質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)了一個磷酸激酶CDK1能與FBXO6相互作用。僅過表達(dá)或者敲除FBXO6對HeLa細(xì)胞的周期沒有明顯的影響。但有趣的是,FBXO6能加快同步化的HeLa有絲分裂期(M期)到G1期的轉(zhuǎn)換。在同步化的細(xì)胞中,過表達(dá)FBXO6能突破有絲分裂檢查點(diǎn)的限制,迫使細(xì)胞強(qiáng)行分裂,最終導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),FBXO6能特異性與有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白Mad2(mitotic a

10、rrest deficient2)和BubRl(Mitotic checkpointserine/threonine-protein kinase BUB1 beta)相互作用,可能通過扣留或者抑制這些檢查點(diǎn)蛋白的活性來突破有絲分裂檢查點(diǎn)的屏障。
　　總之,我們成功的建立了一個蛋白質(zhì)相互作用鑒定平臺。利用該平臺我們系統(tǒng)性的鑒定了FBXO6的相互作用蛋白和糖蛋白.我們發(fā)現(xiàn)FBXO6是一個細(xì)胞周期特異性磷酸化蛋白,對有絲分裂檢查點(diǎn)蛋白