宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因在黑曲霉中表達(dá)的研究.pdf

1、酸性蛋白酶是一類最適pH為2.5～5.0的天冬氨酸蛋白酶。真菌酸性蛋白酶能在低pH條件下，有效水解蛋白質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于酒精、釀酒、食品加工、飼料添加、皮革加工等行業(yè)中，是酶制劑產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要產(chǎn)品，具有很好的商業(yè)開發(fā)價(jià)值。宇佐美曲霉(aspergillus usamii)是傳統(tǒng)的酸性蛋白酶發(fā)酵生產(chǎn)菌，目前利用常規(guī)的育種方法提高其產(chǎn)量的潛力已經(jīng)非常有限，通過基因工程技術(shù)培育工程菌是獲得酸性蛋白酶高產(chǎn)菌株的有效途徑。
　　 黑曲霉是一

2、種因其酶系豐富、代謝產(chǎn)物多而被廣泛應(yīng)用的工業(yè)生微生物。黑曲霉作為基因工程的受體菌有著與細(xì)菌、酵母不同的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)--具有很高的蛋白質(zhì)分泌能力，一些糖化酶生產(chǎn)菌種在理想的培養(yǎng)條件下發(fā)酵分泌糖化酶的產(chǎn)率可達(dá)20g/L發(fā)酵液：能夠正確進(jìn)行各種翻譯后加工，并且與高等真核生物類似；同時(shí)又是公認(rèn)的安全生產(chǎn)菌株，發(fā)酵及后處理技術(shù)成熟。宇佐美曲霉與黑曲霉同為曲霉屬，具有相同的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。因此以黑曲霉糖化酶基因啟動(dòng)子調(diào)控宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因的表達(dá)

3、，有望獲得高效表達(dá)酸性蛋白酶的黑曲霉工程菌，從而達(dá)到提高酸性蛋白酶產(chǎn)量和簡化發(fā)酵條件的目的。
　　 本研究以宇佐美曲霉(aspergillus usamii)為基因供體，通過重疊延伸PCR將宇佐美曲霉酸性蛋白酶基因pepA與黑曲霉糖化酶基因的5’同源臂和3’同源臂進(jìn)行拼接，構(gòu)建pepA基因的表達(dá)框，使酸性蛋白酶基因受糖化酶啟動(dòng)子的調(diào)控。進(jìn)一步構(gòu)建黑曲霉表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化黑曲霉菌絲體，培育酸性蛋白酶工程菌。主要研究結(jié)果

4、如下：
　　 1.黑曲霉表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 采用PCR擴(kuò)增方法，分別獲得宇佐美曲霉中的酸性蛋白酶基因pepA，黑曲霉糖化酶基因的上游片段GLA5和下游片段GLA3。運(yùn)用重疊延伸PCR，將GLA5、GLA3與pepA基因拼接，得到酸性蛋白酶同源重組表達(dá)框GLA5-pepA-GLA3。構(gòu)建農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化黑曲霉的表達(dá)載體pSZH-pepA，其T-DNA區(qū)順向連接酸性蛋白酶基因和潮霉素基因兩個(gè)同源重組表達(dá)框。
　　 2

5、.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉菌絲體遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化
　　 從潮霉素B和頭孢噻肟鈉的篩選壓力、乙酰丁香酮濃度、培養(yǎng)基的選擇、黑曲霉菌齡、共培養(yǎng)時(shí)間以及共培養(yǎng)溫度等方面，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑曲霉菌絲體遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行摸索，最終確定以PDA作為共培養(yǎng)培養(yǎng)基，乙酰丁香酮濃度為200μmol/L的條件下，用菌齡為5d的黑曲霉菌絲體與攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置共培養(yǎng)48h為最佳轉(zhuǎn)化條件。
　　 3.酸性蛋白酶基因在黑

6、曲霉中表達(dá)
　　 以高產(chǎn)糖化酶的黑曲霉工業(yè)生產(chǎn)菌種為受體菌，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將表達(dá)載體pSZH-pepA轉(zhuǎn)化黑曲霉菌絲體，經(jīng)PCR鑒定，在69株穩(wěn)定遺傳的菌株中，共有37株為陽性菌株，其中3株為同源重組轉(zhuǎn)化子。挑取穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子于糖化酶糖化酶搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，34℃條件下300r/min培養(yǎng)3d。取培養(yǎng)液上清，經(jīng)TCA法濃縮蛋白后，進(jìn)行SDS-PAGE，得到約40Kda酸性蛋白酶條帶，說明在糖化酶生產(chǎn)條件下，轉(zhuǎn)入的酸性蛋白酶基因

7、獲得了表達(dá)。進(jìn)一步對重組菌株的發(fā)酵液上清進(jìn)行福林-酚法測定酶活，結(jié)果表明，酸性蛋白酶基因在黑曲霉中得到了表達(dá)，酶活最高達(dá)45.56U/mL，而在出發(fā)菌株中檢測到的酸性蛋白酶酶活僅為3.72U/mL，說明轉(zhuǎn)入的pepA基因已在糖化酶基因啟動(dòng)子調(diào)控下獲得了表達(dá)。
　　 4.黑曲霉重組菌株搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化
　　 將重組菌株在不同條件下?lián)u瓶發(fā)酵，探討pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶量的影響，確定適合重組菌搖瓶發(fā)酵的條件。結(jié)果表明