最適pH降低的中性蛋白酶I基因在米曲霉中的表達(dá).pdf

1、米曲霉（Aspergillus oyzae）能夠分泌高活力的酶，因而被長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用在傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)中。米曲霉中性蛋白酶（neutral protease）的分解作用將原料中的蛋白質(zhì)發(fā)酵水解成多種氨基酸。本研究以米曲霉中性蛋白酶I(NPI)作為對(duì)象，分析糖基化對(duì)蛋白酶活力的影響，并進(jìn)一步構(gòu)建食品級(jí)高活力的中性蛋白酶基因米曲霉工程菌。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1對(duì)中性蛋白酶進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬，分析發(fā)生突變的位置，發(fā)現(xiàn)糖基化位點(diǎn)都發(fā)生在蛋

2、白酶表面。利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得了表達(dá)載體pPIC9K-NPI-P56Y-6His和pPIC9K-NPI-N41AP56Y-6His，轉(zhuǎn)入畢赤酵母Gs115。利用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別在60 h和72 h達(dá)到最大酶活42U/mL和60U/mL。對(duì)表達(dá)的蛋白酶進(jìn)行硫酸銨沉淀和鎳柱純化，SDS-PAGE分析得蛋白分子量大小分別為70 KDa和50 KDa左右。對(duì)中性蛋白酶的活力進(jìn)行測(cè)定：rNPI的酶活為217 U/mg，r

3、NPI-P56Y的酶活為242 U/mg，rNPI-N41AP56Y的酶活為147 U/mg。
　　2以尿嘧啶依賴的米曲霉工程菌AS11為出發(fā)菌株，以0.8M NaCl溶液作為滲透壓緩沖液制備米曲霉原生質(zhì)體，原生質(zhì)體濃度達(dá)到8.5×106個(gè)/mL，再生率為22％。構(gòu)建了打靶載體 pNP-NPI-6His、pNP-NPI-Y122FK246ID382V-6His和pNP-NPI-Y122FK246ID382VY186S-6His。轉(zhuǎn)