米曲霉中性蛋白酶基因在畢赤酵母中的重組表達(dá)及定向進(jìn)化.pdf

1、米曲霉中性蛋白酶(neutral protease)是米曲霉在代謝過程中產(chǎn)生的酶系,主要用于醬油釀造生產(chǎn)中,以大豆或豆粕及小麥或面粉為主要原料,經(jīng)過蛋白酶的分解作用,將蛋白質(zhì)發(fā)酵水解成多種氨基酸,再結(jié)合其它的發(fā)酵產(chǎn)物,經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng),形成具有特殊色澤、滋味和體態(tài)的調(diào)味液。畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種單細(xì)胞真核生物,為甲醇營(yíng)養(yǎng)型,近年來已被廣泛用于商業(yè)化生產(chǎn)外源蛋白,能對(duì)許多蛋白進(jìn)行分泌表達(dá),并產(chǎn)生各種不同的翻

2、譯后修飾過程,如多肽的折疊、糖基化、甲基化、酰化作用等。畢赤酵母表達(dá)外源蛋白過程中發(fā)生的糖基化現(xiàn)象是一種十分重要的翻譯后修飾過程,它能對(duì)蛋白質(zhì)合成過程中的折疊、組裝、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、特定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、識(shí)別和分泌等產(chǎn)生的一系列作用?；诜抢硇栽O(shè)計(jì)的定向進(jìn)化技術(shù)能夠使研究者們?cè)趯?shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬自然進(jìn)化機(jī)制,將自然界需上億年才能完成的進(jìn)化縮短至幾個(gè)月,在短期內(nèi)創(chuàng)造出新的酶類。利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)米曲霉中性蛋白酶進(jìn)行改造,并從中篩選出理想的突變型,可有效改善

3、蛋白酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用,最終為提高原料蛋白質(zhì)利用率及改善醬油風(fēng)味,降低生產(chǎn)成本奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、中性蛋白酶在畢赤酵母中的表達(dá)、純化及性質(zhì)分析
　　構(gòu)建了 pPIC9K-NPI-6His表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入畢赤酵母 GS115并利用BMGY/BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h時(shí)表達(dá)上清酶活達(dá)到最高,為46 U/mL。對(duì)表達(dá)的重組中性蛋白酶進(jìn)行硫酸銨沉淀及鎳柱純化,SDS-PAGE分析純化效果良好,蛋白大小

4、為55 kDa。對(duì)純化后重組中性蛋白酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析:其最適反應(yīng)pH為7.5,在pH7.0的時(shí)候穩(wěn)定性最好;最適反應(yīng)溫度為55 oC,對(duì)其進(jìn)行熱穩(wěn)定性測(cè)定,50 oC以下對(duì)酶活影響不大,置于60 oC時(shí)保溫1 h后,表達(dá)的中性蛋白酶完全失活;金屬離子 Ca2+、 Mg2+、 Li+等對(duì)中性蛋白酶酶活影響不大,但 Zn2+、Cu2+的加入則使中性蛋白酶酶活下降顯著,絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF對(duì)酶活無影響,但金屬離子蛋白酶抑制劑EDTA和

5、Phen使蛋白酶完全失活,表面離子活性劑TritonX-100使中性蛋白酶酶活稍有下降。
　　2、重組中性蛋白酶的糖基化分析
　　對(duì)純化后的NPI進(jìn)行糖基化現(xiàn)象的確定及糖基化位點(diǎn)的鑒定。PAS染色法及Endo H去糖基化處理法確定了NPI重組蛋白發(fā)生了糖基化現(xiàn)象,去糖基化前后蛋白分子量經(jīng) MALDI-TOF-MS測(cè)定分別為54.5 kDa和43.3 kDa,nano LC MS/MS鑒定到其成熟肽段第41位氨基酸Asn為糖基

6、化發(fā)生位點(diǎn)。利用I-TASSER對(duì)NPI蛋白進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬,發(fā)現(xiàn)該糖基化位點(diǎn)位于一處loop環(huán)結(jié)構(gòu)上,與NPI蛋白酶活性中心相距較遠(yuǎn)。利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了N41A去糖基化突變株,通過去除表達(dá)過程中的糖基化現(xiàn)象來研究糖基化作用對(duì)表達(dá)的蛋白酶酶活的影響。突變后蛋白分子量大小降至43 kDa左右,通過測(cè)定突變前后中性蛋白酶酶活并進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)非糖基化的中性蛋白酶幾乎完全喪失酶活,由此證明糖基化作用在NPI表達(dá)過程中產(chǎn)生了重要影響。

7、　　3、提高重組中性蛋白酶熱穩(wěn)定性的定向進(jìn)化
　　利用易錯(cuò)PCR的方法成功構(gòu)建了NPI畢赤酵母隨機(jī)突變文庫,其庫容量為2×104個(gè)重組酵母轉(zhuǎn)化子,50％的重組子仍具有中性蛋白酶活力。在構(gòu)建的隨機(jī)突變文庫中成功篩得一株熱穩(wěn)定性提高的突變體酶,其最適反應(yīng)溫度由野生株的55 oC提高至60 oC,突變后的酶液56 oC半衰期由野生株的7.9 min增長(zhǎng)至16.7 min,為野生株的2.1倍。對(duì)野生型NPI蛋白及S93A突變后NPI蛋白進(jìn)