家蠶絲腺生物反應(yīng)器表達(dá)hGM-CSF轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori），又名桑蠶，屬鱗翅目家蠶蛾科，是迄今為止數(shù)百萬(wàn)種昆蟲(chóng)中僅有的被馴化并大規(guī)模人工飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)。其幼蟲(chóng)具有一對(duì)發(fā)達(dá)的絹絲腺，能夠大量合成分泌絲蛋白。近幾年，以轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)外源蛋白的技術(shù)體系正被逐步建立。但現(xiàn)有的技術(shù)體系存在外源基因表達(dá)量不高，篩選工作量大等問(wèn)題。 本研究以絲蛋白基因啟動(dòng)子構(gòu)建新的基于piggyBac轉(zhuǎn)座子的家蠶轉(zhuǎn)基因載體?？寺〗z素蛋白重鏈基因（fibroin heavy chain，

2、fib—H）、輕鏈基因（fibroin light chain，fib—L）啟動(dòng)子，并以生物信息學(xué)手段分析啟動(dòng)子元件：構(gòu)建fib—H、fib—L啟動(dòng)子控制紅色熒光蛋白（Discosoma red fluorescent protein，DsRed/drFP583）報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)載體，進(jìn)行家蠶體內(nèi)及BmN培養(yǎng)細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)；構(gòu)建分別以fib—H、fib—L啟動(dòng)子控制外源基因的轉(zhuǎn)基因載體；以piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)進(jìn)行家蠶培養(yǎng)細(xì)

3、胞的轉(zhuǎn)基因研究；以構(gòu)建完成的轉(zhuǎn)基因載體初步進(jìn)行家蠶轉(zhuǎn)基因研究。 研究結(jié)果獲得了fib—H啟動(dòng)子（EF540776，489 bp）、fib—L啟動(dòng)子（EF540777，606 bp），fib—L來(lái)源的polyA加尾信號(hào)序列（EF216676，289 bp），fib—L第一內(nèi)含子來(lái)源的增強(qiáng)子序列（enhancer）（DQ679478，375 bp），新霉素抗性基因（neomycin resistance gene，neor）等元件；

4、瞬時(shí)表達(dá)證明克隆的啟動(dòng)子在家蠶后部絲腺組織具有特異性活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在家蠶卵巢來(lái)源的BmN培養(yǎng)細(xì)胞中亦具有一定的活性；以克隆的元件構(gòu)建二種新的轉(zhuǎn)基因載體，除了已有的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）報(bào)告基因外，載體中包括分別以fib—H、fib—L啟動(dòng)子控制外源功能基因hGM—CSF（humangranulocyte—macrophage colony stimulating factor，粒/巨

5、噬細(xì)胞集落刺激因子）并帶有polyA加尾信號(hào)的表達(dá)元件、促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)子元件、可與GFP進(jìn)行雙重篩選的neor基因表達(dá)元件；以帶有neor基因表達(dá)元件和GFP報(bào)告基因的piggyBac轉(zhuǎn)座子載體轉(zhuǎn)化家蠶BmN細(xì)胞，以終濃度800μg/mL的G418（Geneticin）篩選3個(gè)月，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，呈現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞數(shù)約75%，PCR鑒定證實(shí)細(xì)胞基因組DNA中外源基因的存在；構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體初步進(jìn)行家蠶轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，幼蟲(chóng)2齡3d觀察到3