甲型副傷寒沙門氏菌菌體適配體的篩選及應用研究.pdf

1、分類號學校代碼!Q5壘2密級甲型副傷寒沙門氏菌菌體適配體的篩選及應用研究TheselectionandapplicationofaptamersagainstSparatyphiA指導教師姓名、職稱墅巫耋咝湖南師范大學學位評定委員會辦公室二零一三年五月本論文主要開展并完成了一下工作內容：1、通過體外細胞SELEX篩選技術，構建了全長為79nt、中間隨機區(qū)域為40nt的ssDNA文庫(庫容量為280個ssDNA分子)，以甲型副傷寒沙門氏菌

2、(＆paratyphiA)為靶標，采用腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和亞利桑那沙門氏菌作為消減篩選靶標，進行了4輪消減篩選及13輪常規(guī)篩選，成功篩選到一組能高特異性結合＆paratyphiA的核酸適配體。2、利用分子克隆技術，對最后一輪篩選得到的核酸適配體的PCR產物進行克隆，隨機選取100個單克隆子進行測序。最后，一共獲得了27條核酸適配體序列，并對它們進行一級結構的同源性分析及二級結構的模擬分析。用熒光分析法對其親和力

3、進行測定，它們的KD值達到O～100nM范圍，親和力最高的適配體Apt22的KD值為473nM；選擇特異性實驗分析表明，篩選得到的適配體與¶typhiA的結合具有很強的特異性且對同種屬的沙門氏菌不會有交叉結合；用FITC熒光標記的適配體對＆paratyphiA進行定量分析，結果表明在細菌濃度為104～108cfu／ml之間呈現(xiàn)出良好的線性關系；最后，還用FITC標記的適配體成功對¶typhiA進行了激光掃描共聚焦顯微鏡細