減毒傷寒沙門氏菌作為表面展示疫苗載體的應(yīng)用研究.pdf

1、重組活菌載體疫苗是將外源抗原基因插入活菌載體的染色體或質(zhì)粒中,激發(fā)免疫系統(tǒng)提呈該外源抗原并產(chǎn)生有效免疫保護(hù),進(jìn)而達(dá)到預(yù)防一種或多種疾病的目的。減毒沙門氏菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)因具有特殊的優(yōu)點而成為疫苗研究的熱點,被廣泛應(yīng)用于病毒和細(xì)菌等疫苗的研制,并且顯示出良好的應(yīng)用前景。在小鼠模型實驗中證明,使用減毒沙門氏菌株攜帶幽門螺旋桿菌保護(hù)性抗原尿素酶,可以有效將抗原提呈給免疫系

2、統(tǒng)。在減毒傷寒沙門氏菌研究方面已經(jīng)取得了相當(dāng)大的進(jìn)展,它既可以作為一個更有效的傷寒沙門氏菌疫苗,又可以表達(dá)異源抗原。其中最廣泛評估的減毒傷寒沙門菌疫苗候選株是CVD908(Ty2 aroC aroD)以及CVD908-htrA(Ty2 aroC aroD htrA)。
　　 一,利用λRed體內(nèi)重組系統(tǒng),以CVD908為出發(fā)菌株,敲除其染色體上的asd基因,以期構(gòu)建質(zhì)粒-宿主平衡致死系統(tǒng),以便穩(wěn)定地表達(dá)外源抗原。用其基因組為模板

3、,擴增得到asd基因的上下游同源臂,通過酶切連接等方法,將上下游同源臂連接在打靶載體的卡那霉素抗性基因的兩側(cè),以該載體為模板擴增得到高濃度線性打靶片段。將含λRed體內(nèi)重組系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD46電擊轉(zhuǎn)化入CVD908,誘導(dǎo)重組系統(tǒng)表達(dá)后,再將打靶片段轉(zhuǎn)化進(jìn)去,用含卡那霉素平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。使用質(zhì)粒pCP20去除卡納霉素抗性基因,從而得到CVD908的asd基因敲除株。
　　 使用與敲除asd基因相同的方法,在CVD908(Ty

4、2 aroC aroD asd)基礎(chǔ)上敲除了其毒力基因htrA,對其進(jìn)行進(jìn)一步的減毒,并通過PCR和RT-PCR等方法分別在DNA水平和RNA水平進(jìn)行了上述基因敲除的驗證。
　　 二,在平衡致死系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建表面展示載體,并對展示效果進(jìn)行評價。敲除CVD908的asd基因后,菌株出現(xiàn)營養(yǎng)缺陷表型,然后用大腸桿菌(Escherichiacoli)的asd基因進(jìn)行互補。在原始質(zhì)粒pBAD-Assdsbe的基礎(chǔ)上,用大腸桿菌的as

5、d基因替換質(zhì)粒上的氯霉素抗性基因,構(gòu)建平衡致死質(zhì)粒。在質(zhì)粒的阿拉伯糖啟動子后面插入表面展示工具及幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)尿素酶(ureB)基因編碼區(qū)序列,從而得到表面展示載體。然后將該載體電擊轉(zhuǎn)化入減毒沙門氏菌CVD908-htrA(Ty2 aroC aroD asd htrA),得到活菌疫苗株CVD908-htrA-LOU。利用UreB的單抗對疫苗株進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分析、全菌蛋白和外膜蛋白提取結(jié)合免疫印跡分

6、析以及間接免疫熒光觀察分析,都證實UreB蛋白成功展示于菌體表面。
　　 三,對得到的重組菌進(jìn)行安全性評價。通過細(xì)菌侵染小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7和人宮頸癌上皮細(xì)胞Hela細(xì)胞,進(jìn)行侵襲力以及24h胞內(nèi)增殖力實驗,表明CVD908-htrA-LOU較CVD908和野生株Ty2的侵襲力和在胞內(nèi)生存力顯著減弱。此外又進(jìn)行了小鼠半數(shù)致死量的實驗,也表明CVD908-htrA對小鼠的LD50較野生株Ty2提高了三個數(shù)量級,較出發(fā)

7、株CVD908也提高了一個數(shù)量級,充分說明新構(gòu)建的重組菌CVD908-htrA-LOU安全性較野生株Ty2和出發(fā)株CVD908有明顯提高。
　　 四,將表面展示尿素酶B亞單位的活菌疫苗直接口服免疫BalB/C小鼠,進(jìn)行動物體內(nèi)免疫效果的評價。共設(shè)四個免疫組,第一組為生理鹽水組；第二組為空載體組(CVD908-htrA—LO)；第三組為尿素酶表面展示組(CVD908-htrA-LOU)；第四組為尿素酶胞內(nèi)表達(dá)組(CVD908-ht