豬源益生菌的篩選及抗沙門氏菌感染的研究.pdf

1、自發(fā)現(xiàn)青霉素以來，抗生素在多種常見細(xì)菌感染性疾病的治療中發(fā)揮了重要的作用。然而因抗生素濫用導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生、食品的抗生素殘留、住院病人腸道菌群紊亂、水源和土壤的抗生素污染等一系列問題，如今抗生素的負(fù)面作用已引起全球的廣泛關(guān)注。尋找綠色安全、高效無毒的抗生素替代品迫在眉睫。大量研究表明，益生菌在促進(jìn)動(dòng)物生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗細(xì)菌感染、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用，是一種理想的抗生素替代品。
　　本研究擬從偏遠(yuǎn)山區(qū)農(nóng)戶未飼用

2、混合飼料且生產(chǎn)性能優(yōu)良的經(jīng)產(chǎn)母豬糞便中，篩選對(duì)低pH值和高膽鹽有較好耐受性，且同時(shí)產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的芽孢桿菌菌株；篩選耐酸和膽鹽且能同時(shí)抑制Eerichia coli O157:H7、Sphylococcus typhimurium和Slmonella sonnei三種常見腸道致病菌的乳酸桿菌菌株。通過添加到雛雞日糧中，研究其對(duì)雞生長和免疫性能的影響，為高效飼用益生菌制劑產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
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3、挑選重慶山區(qū)從未添食配合飼料且生產(chǎn)性能優(yōu)良的經(jīng)產(chǎn)母豬，采集其新鮮糞便，樣品經(jīng)80℃水浴15 min后在LB培養(yǎng)基上分離細(xì)菌，分離株再經(jīng)pH3.02 h、0.5％膽鹽24 h處理，挑選存活率均高于90%的菌株。用透明圈法檢測(cè)其產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的能力，利用API生化反應(yīng)及16S rDNA片段核苷酸序列進(jìn)行細(xì)菌鑒定。結(jié)果顯示，共分離到7株菌能同時(shí)產(chǎn)生這三種酶，分別命名為P1.1-4、P1.1-10、P1.2-1、P1.2-3、P1.

4、3-1、P1.3-5、P1.4-2。其中，P1.1-4產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)，D/d值為2.03，P1.1-10、P1.3-1具有高產(chǎn)蛋白酶能力，D/d值分別為7.90和6.56，7株菌產(chǎn)纖維素酶能力差異不大，D/d值均在1.5左右。經(jīng)生化鑒定與16S rDNA分子鑒定這7株菌為嗜熱脂肪芽孢桿菌（P1.2-1），地衣芽孢桿菌（P1.3-5）和枯草芽孢桿菌（P1.1-4、P1.1-10、P1.2-3、P1.3-1、P1.4-2）。
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5、.從上述新鮮糞便中分離到6株耐酸、耐膽鹽的乳酸桿菌，經(jīng)生化鑒定與16S rDNA分子鑒定為德氏乳酸桿菌（P3-a），植物乳酸桿菌（P3-b），嗜酸乳酸桿菌（P1.1-a、P1.1-c、P4-a、P5-a）。測(cè)定各菌株對(duì)10種常用抗生素的敏感性，結(jié)果表明，所有菌株對(duì)環(huán)丙沙星和慶大霉素耐藥，對(duì)氯霉素敏感，對(duì)克林霉素、甲硝唑、芐星青霉素、萬古霉素有不同程度的敏感性；P3-b、P5-a對(duì)磺胺沒有明確的耐藥、敏感折點(diǎn)，其余4株乳酸桿菌對(duì)磺胺耐藥；

6、P1.1-a、P1.1-c對(duì)5種抗生素耐藥。平板試驗(yàn)表明這6株乳酸桿菌的培養(yǎng)液對(duì)E.coli O157:H7、S.typhimurium和S.sonnei均有抑制作用，其中，植物乳酸桿菌P3-b對(duì)三種致病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈分別為16.2 mm、15.3 mm和17.8 mm。在MRS中培養(yǎng)24 h后，P1.1-c、P3-a的pH值下降至4.2左右， P1.1-a、P3-b、P4-a、P5-a下降至3.5。將三種致病菌分別接種于用乳

7、酸桿菌P3-b培養(yǎng)液調(diào)制的MRS液體培養(yǎng)基中，其生長曲線均表現(xiàn)為pH值越低生長越緩慢。小鼠試驗(yàn)表明，植物乳酸桿菌P3-b能減輕小鼠感染Citrobacter rodentium所致的體重下降。
　　3.選用產(chǎn)淀粉酶較強(qiáng)的P1.1-4、產(chǎn)蛋白酶較強(qiáng)P1.3-1和抑菌效果最好的乳酸桿菌P3-b來研究豬源益生菌對(duì)雛雞抗沙門氏菌感染的作用。將108 CFU/mL的芽孢桿菌和/或108 CFU/mL的乳酸桿菌拌料飼喂20日齡的海蘭灰雞，一周

8、后感染沙門氏菌（1×1010 CFU/只），并持續(xù)添食益生菌三周。感染后每天檢測(cè)糞便中的沙門氏菌的數(shù)量；每周稱空腹體重并記錄采食量，計(jì)算料重比；將雞處死后后取肌胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、直腸、胰腺、脾臟及法氏囊進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果顯示，感染后1天，各組糞便中檢測(cè)到的沙門氏菌含量差異不大，沙門菌106 CFU/g左右，之后各組致病菌含量隨感染時(shí)間的延長呈下降趨勢(shì)。其中安慰組和芽孢桿菌組下降最快，且在感染6天后糞便中檢測(cè)不到沙門菌；感

9、染對(duì)照組下降最慢，在感染12天后糞便中檢測(cè)不到沙門菌。芽孢桿菌組的平均日增重為7.36 g，料重比為9.6，顯著優(yōu)于感染對(duì)照組（P＜0.05），乳酸桿菌組和混合菌液組略好于感染對(duì)照組。添食益生菌后雞小腸的肌層厚度無明顯變化，單一或復(fù)合添食乳酸桿菌和芽孢桿菌能提高雞大腸段的肌層厚度。單一添食乳酸桿菌對(duì)腸道絨毛長度無顯著影響，添食芽孢桿菌或混合菌能明顯增加腸道的絨毛長度。添食芽孢桿菌的雞脾臟和法氏囊明顯增大，免疫器官指數(shù)顯著高于感染對(duì)照組（

10、P＜0.05)，組織學(xué)觀察顯示法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞大量增生，僅添食乳酸桿菌的雞法氏囊未見明顯變化。雞腸道主要病變?yōu)槟c粘膜分葉核白細(xì)胞浸潤和毛細(xì)血管擴(kuò)張充血或出血。添食芽孢桿菌組和添食混合菌組的腸道粘膜毛細(xì)血管的擴(kuò)張充血和出血較感染對(duì)照組輕微，其中混合菌組與感染對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05）；腸道分葉核白細(xì)胞浸潤程度沒有顯著性差異。
　　綜上所述，本研究從健康豬糞便中篩選出7株產(chǎn)淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶的芽孢桿菌和6株乳酸桿菌。對(duì)雛