綠膿桿菌外毒素A(PEA)入侵細胞的定時定量探究.pdf

1、綠膿桿菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A,PEA)是一種細菌性蛋白質(zhì)毒素,由銅綠假單胞菌屬綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌。PEA可將真核細胞內(nèi)蛋合成白質(zhì)的關鍵延長因子EF-2核糖基化并使其失活,從而使蛋白質(zhì)的合成受到抑制,最終導致細胞的死亡。此前的很多研究集中在PEA毒素催化反應階段,對前期的與細胞膜受體結(jié)合和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運路徑的相關研究較少。
　　為追蹤綠膿桿菌外毒素A進入細胞質(zhì)的時

2、間和效率,我們構(gòu)建四種熒光蛋白標記和兩種海腎熒光素酶標記的綠膿桿菌外毒素A的融合毒素,來探究毒素進入細胞的量與時間的關系,以及毒素進入細胞質(zhì)的路徑。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)加毒素蛋白1小時后,進入細胞質(zhì)的總毒素量占結(jié)合細胞表面總毒素量的14.75％;其中整個毒素片段占11%;酶切后的毒素片段占3.72%。;2小時后達到最大值,之后隨著培養(yǎng)時間的降低有所降低,但降低量并不太大。加入nocodazole后細胞質(zhì)中總毒素量有所降低,加入monesin或N

3、H4Cl后,進入細胞質(zhì)中的整個毒素蛋白分子的量被抑制50%,酶切后的毒素C片段量明顯被完全抑制。
　　為研究綠膿桿菌外毒素A在細胞內(nèi)的裂解和酶切效率,我們運用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescent resonance energy transferring,FRET)的方法設計了具有兩個熒光標簽的PEA融合毒素,如RPG(DsRed2-PE44-eGFP)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)毒素以脈沖形式進入細胞半小時后,供體熒光量開始升高,說明部分毒素