泰山松花粉多糖對羊綠膿桿菌滅活疫苗的免疫增強作用.pdf

1、隨著我國經濟的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對羊肉需求量的不斷擴大，推動了我國養(yǎng)羊業(yè)向規(guī)?；图s化方向發(fā)展。然而隨著養(yǎng)羊產業(yè)的擴大，羊發(fā)生傳染病的種類也不斷地增加。其中呼吸道疾病給羊群的健康帶來很大的威脅，綠膿桿菌作為一種條件性致病菌，感染羊群后發(fā)生慢性化膿性肺炎，造成羊群呼吸困難、咳嗽、流膿性鼻液等，嚴重的可以導致羊只死亡，給養(yǎng)羊業(yè)帶來很大的經濟損失。同時綠膿桿菌病作為一種人畜共患病對人類的健康也帶來很大的威脅。由此可見，對綠膿桿菌

2、的防治顯得尤為重要。
　　目前檢測綠膿桿菌多采用傳統(tǒng)的細菌分離鑒定方法，主要包括細菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗、致病性試驗等。隨著分子生物學檢測技術的發(fā)展與應用，綠膿桿菌的PCR檢測方法也被廣泛地應用。綜合這些方法可以準確的對該菌進行鑒定。養(yǎng)殖場中對綠膿桿菌病的防控多采用加入白油等傳統(tǒng)佐劑制備的滅活疫苗，但是此類疫苗存在局部產生非細菌性炎癥、肉芽腫及降低生產性能等副作用。疫苗中是否可以加入更加安全、高效、綠色的佐劑成為本研究的

3、主要方面。本實驗室前期已經證明松花粉多糖作為免疫佐劑可以增強動物機體的免疫功能。因此，本課題從發(fā)病羊場分離羊綠膿桿菌，并且制備得到了加入泰山松花粉多糖的羊綠膿桿菌滅活疫苗，研究松花粉多糖對其滅活疫苗的免疫增強作用，以其為泰山松花粉作為羊綠膿桿菌滅活疫苗的佐劑提供技術支持和理論依據。
　　本研究分為兩部分:
　　1.羊綠膿桿菌的分離與鑒定
　　對山東省6個地區(qū)10個規(guī)?；驁鏊蜋z的病、死羊進行臨床癥狀觀察、病理學檢查，對

4、所分離的菌株進行常規(guī)細菌學形態(tài)檢測和16S rRNA基因的分子鑒定。試驗結果顯示，從剖檢病死羊的臟器組織中分離出6株細菌(分別命名為PA1-PA6)，分離菌株在普通營養(yǎng)瓊脂上長出淡綠色的菌落，血平板上出現(xiàn)溶血環(huán)。鏡檢顯示均為革蘭氏陰性的短桿菌，藥敏試驗表明對慶大霉素高度敏感，動物致病性試驗顯示對小白鼠具有致病性作用。結合流行病學等初步判定，分離得到的菌株為綠膿桿菌。16S rRNA序列分析結果表明，分離的6株菌與NCBI上發(fā)表的綠膿桿菌

5、16S rRNA序列的同源性為99.9-100％，與其中登錄的YMD-4、B136-33以及LCQ-4序列的綠膿桿菌菌株位于同一分支上，屬于一個亞群，進化樹顯示與從北京地區(qū)分離的B136-33菌株進化關系更近，核苷酸序列同源性為100％。該試驗為羊場綠膿桿菌病的診斷和治療提供了依據。
　　2.泰山松花粉多糖對羊綠膿桿菌滅活疫苗免疫增強作用的研究
　　選取從山東省規(guī)?；驁鲋蟹蛛x得到具有較強致病性的羊綠膿桿菌PA2株，培養(yǎng)、滅

6、活制備得到羊綠膿桿菌滅活菌液。通過水提醇沉法提取泰山松花粉多糖，在羊綠膿桿菌滅活菌液中加入不同濃度泰山松花粉多糖，制備羊綠膿桿菌泰山松花粉多糖滅活疫苗。免疫健康的Balb/c小鼠來研究泰山松花粉多糖對注射羊綠膿桿菌滅活疫苗小鼠的免疫增強功能。試驗結果顯示:泰山松花粉多糖組能提高小鼠的抗體水平、T淋巴細胞轉化率、外周血CD4+和CD8+的含量及IL-2的水平。其中松花粉多糖（多糖mg/體重g）在0.4mg/g時免疫效果最佳。在0.2mg/