通過(guò)定點(diǎn)突變表征綠膿桿菌芳香硫酸酯酶.pdf

1、背景：作為單通道光度法雙酶同測(cè)（SDESA-ELISA）的候選標(biāo)記酶-綠膿桿菌芳香基硫酸酯酶（PAAS）結(jié)構(gòu)已知，但存在比活較低與37℃熱穩(wěn)定性較差這些問(wèn)題，難以滿足應(yīng)用的需要。因此，需要對(duì)此酶進(jìn)行分子工程改造，目前，定點(diǎn)突變因其高效性更多應(yīng)用于實(shí)際操作中。
　　目的：定點(diǎn)突變輔助分析構(gòu)效關(guān)系，獲得高活性高穩(wěn)定性的芳香硫酸酯酶，作為SDESA-ELISA合適的標(biāo)記酶。
　　方法：在活性中心周圍，針對(duì)催化區(qū)域進(jìn)行定點(diǎn)突變，經(jīng)測(cè)

2、序確認(rèn)后，目的片段與含6-His標(biāo)簽的PET-24a載體結(jié)合，構(gòu)成重組質(zhì)粒；經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)，菌體裂解，蛋白純化后；表征各突變體；根據(jù)出現(xiàn)的特殊現(xiàn)象進(jìn)一步分析，再依據(jù)結(jié)果進(jìn)行新一輪設(shè)計(jì)得到相應(yīng)的突變體并表征?；拘再|(zhì)表征：包括SDS-PAGE,PAGE比活，酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，最適pH,金屬離子影響等相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)；反應(yīng)中失活現(xiàn)象探究：各突變體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線對(duì)比，產(chǎn)物的抑制作用及反應(yīng)期此酶穩(wěn)定性，針對(duì)M72K進(jìn)行磁珠吸附分離釋

3、放再反應(yīng)；MALDI-TOF及超高分辨質(zhì)譜直接檢測(cè)酶分子在反應(yīng)期是否發(fā)生修飾作用；對(duì)PAAS和各定點(diǎn)突變體的熱穩(wěn)定性進(jìn)行監(jiān)測(cè)：考察其處于37℃和4℃的半衰期；針對(duì)特殊現(xiàn)象，以同條件下野生型進(jìn)行同期對(duì)比，并進(jìn)行紫外吸收，熒光發(fā)射，同步熒光光譜掃描；以 MALDI-TOF判斷是否發(fā)生修飾作用。針對(duì)PAAS換用不同類型的緩沖液儲(chǔ)存，考察37℃熱穩(wěn)定性差異。
　　結(jié)果：活性中心位置附近定點(diǎn)突變對(duì)此酶的各項(xiàng)性質(zhì)影響很大。與野生型PAAS相比

4、，最適pH，金屬離子影響等方面均出現(xiàn)顯著改變；其中 R55K（幾乎失活）,K375（針對(duì)底物專一性發(fā)生改變）,M72系列（動(dòng)力學(xué)參數(shù)下降約2個(gè)數(shù)量級(jí)）的改變最為突出；PAAS及其大多數(shù)突變體作用于其天然底物對(duì)硝基苯硫酸鉀（PNS）時(shí)，均出現(xiàn)隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，動(dòng)力學(xué)曲線發(fā)生明顯彎曲的現(xiàn)象（反應(yīng)中失活現(xiàn)象），尤其是 M72系列突變體；經(jīng)MALDI-TOF及超高分辨質(zhì)譜結(jié)果顯示在反應(yīng)過(guò)程中可能此酶發(fā)生了硫酸化修飾作用。觀察到突變體M72K37℃

5、pH7.4儲(chǔ)存于不同緩沖液中均存在顯著的熱激活現(xiàn)象,（即在一定時(shí)間內(nèi)37℃pH7.4緩沖液中，M72K隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)PNS比活明顯增加，超過(guò)兩個(gè)數(shù)量級(jí)；）同步追蹤其吸收光譜與熒光光譜并與野生型 PAAS在相同條件下進(jìn)行比較，出現(xiàn)了明顯改變；而PAAS37℃儲(chǔ)存于不同緩沖液中，熱穩(wěn)定性差異較大，處于10mM pH7.4硼酸硼砂時(shí)，半衰期得到明顯延長(zhǎng)。
　　結(jié)論：通過(guò)定點(diǎn)突變后，PAAS各定點(diǎn)突變體酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生巨大改變，甚至出現(xiàn)特