綠膿桿菌集成型群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的篩選與功能研究.pdf

1、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種條件致病的革蘭氏陰性桿菌，在自然界分布廣泛，可導(dǎo)致免疫力下降及囊性纖維化（Cystic Fibrosis,CF）的患者發(fā)病率和死亡率升高，在臨床中引發(fā)嚴(yán)重感染，是導(dǎo)致病人院內(nèi)感染的第三大類致病菌，可同時(shí)侵染動(dòng)植物。由于其內(nèi)在的高抗藥性及獲得性抗藥性，由綠膿桿菌引發(fā)的感染己越來(lái)越難以治愈。研究綠膿桿菌的致病性和耐藥性調(diào)控機(jī)制，進(jìn)而從新的角度防治綠膿桿菌引起的感染已變得極為重要。

2、
　　微生物群體感應(yīng)（QS）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為研究微生物的致病調(diào)控機(jī)理提供了新的途徑。群體感應(yīng)是微生物中廣泛保守存在的一種細(xì)胞與細(xì)胞間的通信機(jī)制，協(xié)調(diào)細(xì)菌各種群體活動(dòng)，研究群體感應(yīng)機(jī)制對(duì)控制和預(yù)防細(xì)菌感染至關(guān)重要。綠膿桿菌采用由las、pqs及rhl以及最新發(fā)現(xiàn)的IQS調(diào)控系統(tǒng)組成的群體感應(yīng)網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)其毒力基因表達(dá)。IQS信號(hào)系統(tǒng)上連中央las系統(tǒng)和磷酸脅迫應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，下接pqs及rhl系統(tǒng)。IQS的產(chǎn)生受las嚴(yán)格控制但同時(shí)也被磷酸貧

3、乏狀況激活，磷酸匱乏是細(xì)菌感染過(guò)程中的常見(jiàn)脅迫信號(hào)。阻斷 IQS合成導(dǎo)致pqs及rhl系統(tǒng)的群體感應(yīng)癱瘓并顯著降低菌株毒力。雖然IQS被成功分離并且其信號(hào)通路已經(jīng)進(jìn)行了初步的研究，但是IQS上下游調(diào)控機(jī)制并未完全清楚。因此，進(jìn)一步完善IQS的調(diào)控機(jī)制對(duì)將來(lái)針對(duì)IQS調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尋找新的靶標(biāo)來(lái)治療綠膿桿菌造成的感染具有重要意義。
　　本課題重點(diǎn)研究集成型群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，主要工作包括以下兩個(gè)部分：
　?。?）構(gòu)建Tn5轉(zhuǎn)座子

4、插入突變體庫(kù)，在低磷條件下，以綠膿毒素為篩選標(biāo)記篩選綠膿毒素產(chǎn)量降低的突變體，自37,189個(gè)突變體菌株中獲得了1株綠膿毒素產(chǎn)量降低的PAO1插入突變體，命名為Pch996，利用hiTAIL-PCR方法獲得突變基因的全序列。Pch996突變?cè)赑A5295這個(gè)基因中，該基因全長(zhǎng)為1,677 bp，編碼558個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)包含兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別是 GGDEF結(jié)構(gòu)域和 EAL結(jié)構(gòu)域。與野生型PAO1相比，該突變體綠膿毒素產(chǎn)量降低了約

5、35％左右。功能互補(bǔ)后cPch996綠膿毒素產(chǎn)量恢復(fù)至野生型水平，該基因與硝化還原假單胞菌Pseudomonas nitroreducens的二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶有79%的一致性，與門多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina的有77%的一致性。突變體Pch996不僅影響了綠膿毒素的產(chǎn)量，還引起其它表型的變化，如生物膜形成、群集運(yùn)動(dòng)能力、線蟲(chóng)殺死能力，但不影響游動(dòng)性和彈性蛋白酶的產(chǎn)量。同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)，Pch99

6、6插入失活后，4個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量都受到了不同程度的影響。
　?。?）通過(guò)前期研究與生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)，對(duì)PA3192、PA3271、PA4596這3個(gè)可能的IQS調(diào)控基因進(jìn)行研究。PA3192編碼雙組份系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，PA3271編碼雙組份系統(tǒng)的感應(yīng)蛋白，PA4596編碼一個(gè)屬于TetR_N家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。通過(guò)基因敲除獲得敲除突變體，表型測(cè)定結(jié)果表明：敲除PA3192和PA3271后，均影響了綠膿毒素產(chǎn)量、生物

7、膜形成、游動(dòng)性和群集性、對(duì)線蟲(chóng)的致死能力，不影響彈性蛋白酶產(chǎn)量；敲除 PA4696后，綠膿毒素產(chǎn)量下降，運(yùn)動(dòng)性和群集性無(wú)明顯變化，對(duì)線蟲(chóng)的致死能力有所減弱，不影響彈性蛋白酶產(chǎn)量。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)敲除突變體4個(gè)群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，3株敲除突變體的las、rhl、pqs和IQS群體感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)量均受到不同程度的影響。
　　綜上所述，通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變和有針對(duì)性的基因缺失突變，本研究鑒定了4個(gè)潛在的與IQ