綠膿桿菌集成型群體感應系統(tǒng)相關基因的篩選與功能研究.pdf

1、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種條件致病的革蘭氏陰性桿菌，在自然界分布廣泛，可導致免疫力下降及囊性纖維化（Cystic Fibrosis,CF）的患者發(fā)病率和死亡率升高，在臨床中引發(fā)嚴重感染，是導致病人院內(nèi)感染的第三大類致病菌，可同時侵染動植物。由于其內(nèi)在的高抗藥性及獲得性抗藥性，由綠膿桿菌引發(fā)的感染己越來越難以治愈。研究綠膿桿菌的致病性和耐藥性調(diào)控機制，進而從新的角度防治綠膿桿菌引起的感染已變得極為重要。

2、
　　微生物群體感應（QS）現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為研究微生物的致病調(diào)控機理提供了新的途徑。群體感應是微生物中廣泛保守存在的一種細胞與細胞間的通信機制，協(xié)調(diào)細菌各種群體活動，研究群體感應機制對控制和預防細菌感染至關重要。綠膿桿菌采用由las、pqs及rhl以及最新發(fā)現(xiàn)的IQS調(diào)控系統(tǒng)組成的群體感應網(wǎng)絡協(xié)調(diào)其毒力基因表達。IQS信號系統(tǒng)上連中央las系統(tǒng)和磷酸脅迫應激反應機制，下接pqs及rhl系統(tǒng)。IQS的產(chǎn)生受las嚴格控制但同時也被磷酸貧

3、乏狀況激活，磷酸匱乏是細菌感染過程中的常見脅迫信號。阻斷 IQS合成導致pqs及rhl系統(tǒng)的群體感應癱瘓并顯著降低菌株毒力。雖然IQS被成功分離并且其信號通路已經(jīng)進行了初步的研究，但是IQS上下游調(diào)控機制并未完全清楚。因此，進一步完善IQS的調(diào)控機制對將來針對IQS調(diào)控網(wǎng)絡尋找新的靶標來治療綠膿桿菌造成的感染具有重要意義。
　　本課題重點研究集成型群體感應系統(tǒng)的調(diào)控機制，主要工作包括以下兩個部分：
　?。?）構建Tn5轉座子

4、插入突變體庫，在低磷條件下，以綠膿毒素為篩選標記篩選綠膿毒素產(chǎn)量降低的突變體，自37,189個突變體菌株中獲得了1株綠膿毒素產(chǎn)量降低的PAO1插入突變體，命名為Pch996，利用hiTAIL-PCR方法獲得突變基因的全序列。Pch996突變在PA5295這個基因中，該基因全長為1,677 bp，編碼558個氨基酸，編碼的蛋白質包含兩個功能結構域，分別是 GGDEF結構域和 EAL結構域。與野生型PAO1相比，該突變體綠膿毒素產(chǎn)量降低了約

5、35％左右。功能互補后cPch996綠膿毒素產(chǎn)量恢復至野生型水平，該基因與硝化還原假單胞菌Pseudomonas nitroreducens的二鳥苷酸環(huán)化酶有79%的一致性，與門多薩假單胞菌Pseudomonas mendocina的有77%的一致性。突變體Pch996不僅影響了綠膿毒素的產(chǎn)量，還引起其它表型的變化，如生物膜形成、群集運動能力、線蟲殺死能力，但不影響游動性和彈性蛋白酶的產(chǎn)量。同時，通過實時熒光定量 PCR檢測，Pch99

6、6插入失活后，4個群體感應系統(tǒng)相關基因的表達量都受到了不同程度的影響。
　　（2）通過前期研究與生物信息學的預測，對PA3192、PA3271、PA4596這3個可能的IQS調(diào)控基因進行研究。PA3192編碼雙組份系統(tǒng)的反應調(diào)節(jié)蛋白，PA3271編碼雙組份系統(tǒng)的感應蛋白，PA4596編碼一個屬于TetR_N家族的轉錄調(diào)控因子。通過基因敲除獲得敲除突變體，表型測定結果表明：敲除PA3192和PA3271后，均影響了綠膿毒素產(chǎn)量、生物

7、膜形成、游動性和群集性、對線蟲的致死能力，不影響彈性蛋白酶產(chǎn)量；敲除 PA4696后，綠膿毒素產(chǎn)量下降，運動性和群集性無明顯變化，對線蟲的致死能力有所減弱，不影響彈性蛋白酶產(chǎn)量。通過RT-qPCR檢測敲除突變體4個群體感應系統(tǒng)相關基因的表達量，結果表明，3株敲除突變體的las、rhl、pqs和IQS群體感應系統(tǒng)相關基因的表達量均受到不同程度的影響。
　　綜上所述，通過轉座子誘變和有針對性的基因缺失突變，本研究鑒定了4個潛在的與IQ