左氧氟沙星對(duì)綠膿桿菌生物膜誘導(dǎo)作用及藥物治療方法研究.pdf

1、綠膿桿菌(P.Aeruginosa)也稱銅綠假單胞菌，是目前引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一，它的耐藥機(jī)制很多，而生物膜的形成是一個(gè)很重要的耐藥機(jī)制，也是引起臨床治療失敗的很重要原因。經(jīng)過對(duì)銅綠假單胞菌生物膜形成機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌形成生物膜的過程中除了群體感應(yīng)系統(tǒng)(QS系統(tǒng))之外，還存在著另一種調(diào)節(jié)機(jī)制—喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)(PQS系統(tǒng))，喹諾酮類信號(hào)分子在生物膜的形成機(jī)制中則是作為PQS調(diào)控系統(tǒng)的主要的信號(hào)分子。喹諾酮類藥物的結(jié)構(gòu)與

2、喹諾酮信號(hào)分子相似，都是以喹啉環(huán)為主體的結(jié)構(gòu)，那么喹諾酮類藥物在生物膜的形成中到底充當(dāng)什么角色?它能否誘導(dǎo)生物膜的形成?臨床上有哪些藥物能夠穿透生物膜，從而更有效的治療銅綠假單胞菌生物膜引起的感染？本文圍繞著上面的問題，展開了以下研究。
　　 ㈠左氧對(duì)生物膜誘導(dǎo)作用及其它藥物對(duì)生物膜形成的影響。
　　 目的：用左氧氟沙星體外誘導(dǎo)銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株與臨床分離菌株，觀察左氧氟沙星對(duì)銅綠假單胞菌形成生物膜的誘導(dǎo)作用；在實(shí)驗(yàn)里

3、加入阿奇霉素、亞胺培南與氨溴索，觀察這些藥物對(duì)生物膜的作用，觀察是否能破壞細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)或延遲生物膜的形成。實(shí)驗(yàn)用菌株：三株銅綠假單胞菌，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853為本室保存菌株，其余兩株為野生菌株，臨床分離獲得。
　　 方法：(1)使用左氧氟沙星誘導(dǎo)銅綠假單胞菌，細(xì)菌經(jīng)四十代的誘導(dǎo)后，用銀染與電鏡兩種方法觀察生物膜，與誘導(dǎo)前的菌株進(jìn)行對(duì)比，觀察左氧氟沙星在誘導(dǎo)銅綠假單胞菌生物膜形成上的作用。(2)取六株銅綠假單胞菌(使用左氧氟

4、沙星誘導(dǎo)前后的各3株)，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)，放入培養(yǎng)液不經(jīng)培養(yǎng)直接加入阿奇霉素、亞胺培南、氨溴索，觀察同一時(shí)間內(nèi)生物膜的形成情況。另取同樣的六株銅綠假單胞菌，培養(yǎng)足夠的時(shí)間，形成生物膜后，加入阿奇霉素、亞胺培南、氨溴索，通過振蕩和高溫高壓的方法，比較已形成生物膜的變化。取使用左氧氟沙星誘導(dǎo)前后的銅綠假單胞菌菌株各3株，培養(yǎng)形成生物膜后，加入氨溴索，電鏡觀察它們的區(qū)別。
　　 結(jié)果：(1)標(biāo)準(zhǔn)菌株編號(hào)H007，野生菌株編號(hào)P012、P0

5、33，誘導(dǎo)四十代后產(chǎn)生菌株編號(hào)：H031、H038、H039。從銀染和電鏡的結(jié)果中可以看出在同一時(shí)間內(nèi)經(jīng)過左氧氟沙星誘導(dǎo)的銅綠假單胞菌，與未經(jīng)使用左氧氟沙星誘導(dǎo)的銅綠假單胞菌形成的生物膜差別明顯。(2)從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中加入阿奇霉素、亞胺培南后可以看出經(jīng)左氧氟沙星誘導(dǎo)后的菌株，加入阿奇霉素和亞胺培南后生物膜形成的時(shí)間比未經(jīng)過誘導(dǎo)的菌株產(chǎn)生生物膜的時(shí)間早。未加入阿奇霉素與業(yè)胺培南的菌株比加入阿奇霉素、業(yè)胺培南的菌株形成生物膜的時(shí)間早。加入阿奇霉

6、素、亞胺培南的菌株振蕩后生物膜恢復(fù)的速度比不加入阿奇霉素、亞胺培南的菌株慢。高溫高壓之后被左氧氟沙星誘導(dǎo)過的銅綠假單胞菌生物膜經(jīng)過125℃、0.15MPa的高壓20min，生物膜仍然完好無損，加業(yè)胺培南的管經(jīng)過高壓后生物膜消失。加入氨溴索后，電鏡下觀察經(jīng)左氧氟沙星誘導(dǎo)和未經(jīng)左氧氟沙星誘導(dǎo)的銅綠假單胞菌菌株生物膜表面都被打上孔洞。
　　 ㈡建立體外銅綠假單胞菌生物膜形成的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱b置。
　　 目的：按照文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的方法進(jìn)行改

7、進(jìn)，用0.22μm微孔濾膜建立一個(gè)體外生物膜模型，并且用此裝置進(jìn)行能透過生物膜的藥物篩選，用高效液相色譜儀檢測透過生物膜的藥物的含量。實(shí)驗(yàn)用菌株：兩株銅綠假單胞菌，一株為標(biāo)準(zhǔn)菌株H007，另一株為第一部分通過左氧氟沙星誘導(dǎo)而得到的H031。
　　 方法：建立裝置，使用氨溴索促進(jìn)環(huán)丙沙星透過實(shí)驗(yàn)用于檢驗(yàn)裝置是否建立成功。用精密度實(shí)驗(yàn)檢測裝置使用的可重復(fù)性。
　　 結(jié)果：未使用左氧氟沙星誘導(dǎo)的銅綠假單胞菌中，未加入氨溴索的菌

8、株環(huán)丙沙星透過的量為3.136μg·ml-1和3.270μg·ml-1，透過率為3.136％和3.270％，加入氨溴索后，環(huán)丙沙星的透過量為3.911μg·ml-1和4.3796μg·ml-1，透過率為3.911％和4.379％；使用左氧氟沙星誘導(dǎo)的銅綠假單胞菌，未加入氨溴索的菌株，環(huán)丙沙星的透過量為1.6557μg·ml-1和1.6825μg·ml-1，環(huán)丙沙星的透過率為1.6557％和1.6825％，加入氨溴索的菌株中，環(huán)丙沙星的透

9、過量為3.4660μg·ml-1和3.4206μg·ml-1，透過率為3.4660％和3.4206％。
　　 ㈢氨溴索分別與四種抗生素聯(lián)合使用對(duì)銅綠假單胞菌生物膜的透過作用。
　　 目的：篩選能夠透過銅綠假單胞菌生物膜的抗生素，為臨床上治療生物膜感染提供科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)用菌株：三株銅綠假單胞菌，一株為標(biāo)準(zhǔn)菌株H007，另兩株為實(shí)驗(yàn)一通過左氧氟沙星誘導(dǎo)而得到的H031和H039。
　　 方法：用氨溴索分別與亞胺培南、

10、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶作為透過生物膜的藥物，分別用這幾種藥單獨(dú)使用作為對(duì)照，使用5％～100％MeOH/H2O，40min濃度梯度，用島津20A高效液相DAD檢測儀LC-Solution工作站進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：頭孢哌酮/舒巴坦有峰，并且峰的紫外吸收特征峰與純品在此處的紫外特征吸收相似，說明頭孢哌酮/舒巴坦有可能透過生物膜，對(duì)于加入氨溴索后的作用，頭孢哌酮/舒巴坦還是能透過生物膜，且透過量增加。

11、>　　 ㈣驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
　　 目的：在不同的高效液相條件下(島津LC-10A)檢測氨溴索對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的透過作用。實(shí)驗(yàn)用菌株：兩株銅綠假單胞菌，一株為標(biāo)準(zhǔn)菌株H007，另一株為左氧氟沙星誘導(dǎo)得到的H031。
　　 方法：分別使用頭孢哌酮/舒巴坦與頭孢哌酮/舒巴坦+氨溴索作為透過生物膜的藥物，用島津LC-10A高效液相SPD-10AD紫外檢測器、浙大N2000工作站檢測其透過峰高度。
　　 結(jié)果：只加入頭孢哌酮

12、/舒巴坦的裝置，透過頭孢哌酮/舒巴坦色譜吸收峰高為185.091mAU，同時(shí)加入頭孢哌酮/舒巴坦和氨溴索的裝置，透過頭孢哌酮/舒巴坦色譜吸收峰高為207.233mAU。
　　 結(jié)論：⑴左氧氟沙星能誘導(dǎo)生物膜的形成。⑵阿奇霉素、亞胺培南有抑制生物膜生長的作用，但是對(duì)于已形成的生物膜無效。氨溴索可以在形成生物膜的表面上打孔。⑶頭孢哌酮/舒巴坦可以透過生物膜，加入氨溴索之后頭孢哌酮/舒巴坦透過生物膜的濃度增加，此實(shí)驗(yàn)提示這兩種藥合用可