BmNPV多角體基因(phlh)啟動子結(jié)合蛋白的研究.pdf

1、多角體啟動子在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中被廣泛應(yīng)用，因其具有高效啟動外源基因表達(dá)的能力，但是其調(diào)控機(jī)制迄今為止還尚闡明。因此，在本研究中以家蠶桿狀病毒(BmNPV)多角體基因polh啟動子為研究對象，利用酵母單雜交技術(shù)篩選與多角體啟動子序列相結(jié)合的蛋白因子，并對篩選蛋白因子的功能進(jìn)行了研究。
　　首先提取感染了BmNPV的家蠶BmN細(xì)胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，構(gòu)建基因表達(dá)文庫。然后，利用酵母單雜交系統(tǒng)篩選與多角體啟動子序列結(jié)合的蛋白

2、。通過篩選、測序，共鑒定出18個(gè)能與polh啟動子序列相互作用的蛋白。通過生物信息學(xué)分析，挑選了3個(gè)基因（lef5、orf61和p6.9）作進(jìn)一步研究。為驗(yàn)證篩選出基因的功能，分別將原核表達(dá)并純化的三種蛋白:lef5、orf61和p6.9進(jìn)行EMSA分析，結(jié)果表明，orf61能與polh的啟動子序列相互作用。為了進(jìn)一步鑒定三種蛋白的功能，利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建lef5、orf61和p6.9的瞬時(shí)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染病毒Bacimd-Luc感染

3、的BmN細(xì)胞，定量檢測報(bào)告基因Luc的表達(dá)情況。結(jié)果顯示lef5、orf61和p6.9均對polh啟動子具有正調(diào)控作用。然后，又利用基因敲除技術(shù)，進(jìn)一步研究了3個(gè)基因的功能。通過Red重組技術(shù)構(gòu)建了基因敲除型病毒lef5-ko-Bacmid、orf61-ko-Bacmid和p6.9-ko-Bacmid，通過Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建了補(bǔ)回型病毒lef5-re-Bacmid、orf61-re-Bacmid和p6.9-re-Bacmid，

4、然后將構(gòu)建的病毒分別轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)lef5、orf61和p6.9缺失型病毒TCID50均為0，修復(fù)型病毒與野生型病毒TCID50無明顯差異(p＞0.05)，說明3種基因缺失均導(dǎo)致不能形成有感染活性的病毒粒子(BV)。其中，orf61缺失型對病毒基因組復(fù)制有顯著影響(p＜0.05)，lef5和p6.9沒有明顯影響(p＞0.05)，說明orf61可能是病毒基因組復(fù)制的必需基因。此外，為了了解3種基因的缺失對BmNPV其他基因表

5、達(dá)的影響，選取了病毒早期基因lef3、晚期基因vp39和極晚期基因p10進(jìn)行熒光定量PCR分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種基因的缺失，均會對病毒的早期、晚期和極晚期基因的轉(zhuǎn)錄水平有顯著影響(p＜0.05)。
　　綜上所述，利用酵母單雜交技術(shù)篩選獲得的lef5、orf61和p6.9，其中證明ORF61蛋白可與BmNPV polh啟動子序列相結(jié)合，它們的表達(dá)水平可直接影響polh的啟動和表達(dá)水平;此外，3種基因?qū)mNPV的早期、晚期和極晚期