視蛋白基因啟動子-綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf

1、第一軍醫(yī)大學碩士學位論文視蛋白基因啟動子綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的建立姓名：李振林申請學位級別：碩士專業(yè)：組織胚胎學指導教師：安靚胡以平2002.6.6論文摘要(視網(wǎng)膜是視神經(jīng)系統(tǒng)中的‘個重要的組成部分，視網(wǎng)膜和中樞神經(jīng)系統(tǒng)都來源于神經(jīng)管，因此視網(wǎng)膜的許多發(fā)育特征可以反映出腦發(fā)育的一些重要特點，研究視網(wǎng)膜發(fā)育是研究腦發(fā)育的一個重要窗口。視網(wǎng)膜病變也是致盲的一個重要原因，是影響人類健康的危害之一，如由視網(wǎng)膜光感受細胞內(nèi)的基因突變造成的遺傳性

2、視網(wǎng)膜色素變性等。研究視網(wǎng)膜發(fā)育和功能特性，特別是光感受細胞的特性，將為這些疾病的研究和進一步治療奠定基礎。深入這一領域的研究，動物模型是直接和有效的，最常用的就是轉(zhuǎn)基因小鼠。小鼠與人在基因組結(jié)構(gòu)和基因功能方面有極強的相似性，同時繁殖快、飼養(yǎng)費用較低，因此轉(zhuǎn)基因小鼠成為目前體內(nèi)實驗研究體系的最優(yōu)選的方法。本實驗的目的旨在制作出視網(wǎng)膜的視感受細胞百效表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，用來標記視網(wǎng)膜，研究視網(wǎng)膜發(fā)育和用作視網(wǎng)膜移植實驗等實驗體系

3、?！段覀儚幕蚪M中擴增出視蛋白基因5’端上游21kb的調(diào)控序列片段，該序列能夠特異而有效的調(diào)控目的基因在視網(wǎng)膜中表達。進而將這一調(diào)控區(qū)與含有綠色熒光蛋白cDNA的真核表達載體pEGFPC1進行重組，獲得了調(diào)控綠色熒光蛋白在視網(wǎng)膜內(nèi)表達的真核表達載體，命名為ROP—GFP。將ROPGFP線性化后，注射入小鼠受精卵的雄原核中，再將該受精卵重新植入假孕小鼠體內(nèi)，使其生長發(fā)育，生出新生小鼠。用PCR對新生小鼠進行初步篩選獲得了3只陽性小鼠，用陽

4、性Founder小鼠傳代。子l代的小鼠出生14天后初步篩選得到9只陽性小鼠。傳代成功同時，將其中1只Founder小鼠的眼球取下做冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白在視網(wǎng)膜中有較強的表達。1L在本次研究中(1)用綠色熒光蛋白特異性標記視網(wǎng)膜的動物模型僅限于兩棲類和某些魚，而本研究則嘗試用綠色熒光蛋白特異性標記一種哺乳動物(小鼠)的視網(wǎng)膜。首次獲得了視網(wǎng)膜表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。(2)本研究采用21kb的啟動子序列，雖然較