內(nèi)毒素休克小鼠RIG-I基因啟動子結(jié)合蛋白的篩選及鑒定.pdf

1、目的:維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid-induced gene，RIG-Ⅰ)具有抗病毒、殺滅微生物、抗腫瘤、介導(dǎo)免疫反應(yīng)等生物學(xué)作用，并在機體多種組織和細胞中都有表達，不同刺激在不同細胞、不同種系可能通過不同的信號通路誘導(dǎo)RIG-Ⅰ基因的表達，相關(guān)的調(diào)控機制也不盡相同。目前對人源性RIG-Ⅰ基因相關(guān)的調(diào)控機制及其在內(nèi)毒素休克模型中的表達機制則知之甚少。因此我們的實驗?zāi)康闹荚诹私鈨?nèi)毒素休克中哪些蛋白參與了人RIG-Ⅰ基因的表

2、達調(diào)控。
　　方法:用RT-PCR方法檢測LPS對小鼠肝組織RIG-Ⅰ mRNA表達的影響;腹腔注射LPS法制備內(nèi)毒素休克小鼠模型;用核質(zhì)分離的方法提取正常小鼠和內(nèi)毒素休克小鼠肝組織核蛋白;設(shè)計合適的引物，用PCR方法擴增人RIG-Ⅰ啟動子探針;然后從“組學(xué)”的角度和活體組織水平，根據(jù)DNA-蛋白質(zhì)相互作用的原理，基于生物素-鏈親和素系統(tǒng)、磁珠分離技術(shù)，2-D DIGE分離差異蛋白等技術(shù)篩選正常小鼠和內(nèi)毒素休克小鼠肝臟組織中能與人

3、RIG-Ⅰ啟動子發(fā)生相互作用的結(jié)合蛋白;并用質(zhì)譜技術(shù)對篩選出來的部分蛋白進行質(zhì)譜鑒定;最后利用生物學(xué)軟件對鑒定出來的蛋白進行簡單的功能查找及蛋白亞細胞定位分析。
　　結(jié)果:小鼠肝組織RIG-Ⅰ mRNA的表達與LPS刺激存在著時間依賴的關(guān)系，LPS（25mg/kg）腹腔注射小鼠后，小鼠肝組織中RIG-Ⅰ mRNA的表達先增多后減少;頸動脈插管，LPS(25mg/kg)腹腔注射小鼠后，150min時小鼠平均動脈血壓降低至40mmHg

4、，提示內(nèi)毒素休克小鼠模型制備成功;用SDS-PAGE方法分離了正常小鼠和內(nèi)毒素休克小鼠肝組織胞漿蛋白和胞核蛋白，胞漿蛋白和胞核蛋白帶型明顯不同，提示小鼠肝組織核蛋白提取成功;用DNA-Pull down分析、2-D DIGE技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)綜合分析后得到15個可能參與人RIG-Ⅰ啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的蛋白分子，分別為:四聯(lián)重復(fù)肽蛋白29(Tetratricopeptide repeat protein29)、轉(zhuǎn)錄輔助因子HES-6（Tran

5、scription cofactor HES-6）、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶7（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase7）、鈣蛋白酶-6（Calpain-6）、鉀電壓門控通道亞科F成員1(Potassium voltage-gated channel subfamily F member1)、張力蛋白-3(Tensin-3)、Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子1(Rho guanine n

6、ucleotideexchange factor1)、組氨酰-tRNA合成酶（Histidyl-tRNA synthetase）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TAO3(Serine/threonine-protein kinase TAO3)、富含亮氨酸重復(fù)和WD重復(fù)蛋白1(Leucine-rich repeat and WD repeat-containing protein1)、E3泛素蛋白連接酶HUWE1(E3 ubiquitin-pr

7、otein ligase HUWE1)、細胞分裂蛋白激酶18(Cell division protein kinase18)、40S核糖體蛋白SA(40S ribosomal proteinSA)、核不均一核糖核蛋白A3(Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3)、延伸因子1(Elongation factor1-delta);最后用生物學(xué)軟件對鑒定出來的蛋白進行了簡單的功能查找及亞細胞定位分