抗BmNPV誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)基因干涉載體的構(gòu)建.pdf

1、家蠶核型多角體病是由家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrosisvirus，BmNPV)感染家蠶所引起的一種傳染性蠶病，是蠶業(yè)生產(chǎn)上的主要病害，極大地危害了蠶業(yè)生產(chǎn)。提高家蠶品種對病毒的抵抗性和培育抗病品種是防治傳染性蠶病的有效措施。RNAi所介導(dǎo)的基因沉默能抑制病毒基因的復(fù)制，其與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合為培育抗病毒家蠶品種提供了新的方法。利用強(qiáng)的組成型啟動子雖能提高RNAi效率，但是外源基因的組成性表達(dá)

2、對轉(zhuǎn)基因家蠶的發(fā)育會造成一定的影響。因此篩選合適的啟動子，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)dsRNA的載體，在提高dsRNA表達(dá)水平的同時減少外源基因組成性表達(dá)的負(fù)荷，將為最終獲得具有BmNPV高度抗性的轉(zhuǎn)基因家蠶育種素材奠定基礎(chǔ)。本文通過熒光素酶報告基因載體pGL3對所選擇的誘導(dǎo)型啟動子(plef3和p39k)進(jìn)行檢測，構(gòu)建了抗BmNPV誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)基因干涉載體。主要的研究結(jié)果如下：
　　 1、誘導(dǎo)型啟動子的選擇與克隆
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報

3、道及桿狀病毒的級聯(lián)調(diào)控特征，對于BmNPV基因啟動子進(jìn)行分析，初步選擇并克隆了39k基因和lef3基因的啟動子區(qū)域。測序結(jié)果顯示：所克隆的啟動子均包含啟動子轉(zhuǎn)錄核心區(qū)域，存在明顯的桿狀病毒啟動子特征序列，含有TATA框，加帽位點(diǎn)，早期基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的保守序列(CAGT)，翻譯起始密碼子ATG等，序列上符合真核生物啟動子的特點(diǎn)。
　　 2、啟動子活性檢測
　　 利用連接有BmNPV的39k及l(fā)ef3啟動子的熒光素酶報告基

4、因重組載體pGL3-39k及pGL3-lef3轉(zhuǎn)染Sf9及BmE-SWU1兩種細(xì)胞，檢測了兩種啟動子的活性。發(fā)現(xiàn)當(dāng)在AcMNPV及BmNPV兩種桿狀病毒感染宿主細(xì)胞時，均會誘導(dǎo)BmNPV的39k啟動子的活性上調(diào)。在異源細(xì)胞Sf9中的組成型活性較低，但病毒感染后的誘導(dǎo)活性會大大提高(相對酶活由0.411提高到64.9268，感染后約為感染前的158倍)。同樣的，在宿主細(xì)胞BmE-SWU1被病毒感染后的39k啟動子活性增加(相對酶活由6.0

5、151提高到12.6497，感染病毒后約為感染病毒前的2.103倍)。并且39k啟動子活性在Sf9細(xì)胞中的組成型活性非常低，但在BmE-SWU1中組成型活性較高。而lef3啟動子在有無病毒感染的情況時活性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于39k啟動子活性(P＜0.01)。進(jìn)一步在BmE-SWU1細(xì)胞中測定了39k啟動子在轉(zhuǎn)染后各個時間點(diǎn)的活性，發(fā)現(xiàn)隨著時間的推移，39k啟動子的表達(dá)不斷提高且感染BmNPV的組中39k啟動子的活性明顯高于未感染BmNPV的組中3

6、9k啟動子的活性(P＜0.01)
　　 3、轉(zhuǎn)基因RNAi干涉載體的構(gòu)建及細(xì)胞水平上的抗病毒檢測
　　 分析確定了RNAi載體的結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了可以在家蠶細(xì)胞中產(chǎn)生穩(wěn)定的雙鏈發(fā)夾狀RNA(hpRNA)的轉(zhuǎn)基因RNAi載體。進(jìn)一步利用抗生素G418對于瞬時轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因載體的家蠶細(xì)胞進(jìn)行篩選培養(yǎng)，近4個月后建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，接種Bm-BacPAK6病毒后，檢測了病毒的增殖情況。研究表明：當(dāng)用較高的病毒濃度滴度(1.01