豬AGL基因啟動(dòng)子活性初步研究.pdf

1、AGL基因編碼的糖原脫脂酶是參與糖原降解的一種復(fù)合酶,包括α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和淀粉-1,6-葡糖苷酶、脫支酶兩種功能。目前,人和馬的AGL基因的研究主要集中于結(jié)構(gòu)和功能。有關(guān)于豬AGL基因的研究報(bào)道比較少。本文以豬AGL5’側(cè)翼序列為研究對(duì)象,探討5’側(cè)翼序列的啟動(dòng)子活性,主要研究結(jié)果如下:
　　 豬AGL5’側(cè)翼序列啟動(dòng)子活性研究
　　 構(gòu)建AGL5’側(cè)翼序列驅(qū)動(dòng)的蟲熒光素酶基因表達(dá)質(zhì)粒pGL3-5’UTR,轉(zhuǎn)染LO2細(xì)

2、胞。轉(zhuǎn)染48h后用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒,檢測熒光素酶的表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染24h后用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)檢測蟲熒光素酶基因mRNA水平。與陰性對(duì)照pGL3-basic作比較,pGL3-5’UTR有顯著的蟲熒光素酶表達(dá)(P<0.01)；反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)也得到相符的結(jié)果,pGL3-5’UTR檢測到蟲熒光素酶基因mRNA。結(jié)果表明,AGL5’側(cè)翼序列具有成熟的啟動(dòng)子活性,能夠啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。
　　 豬AGL5’側(cè)翼序列啟動(dòng)子活性的結(jié)

3、構(gòu)定位
　　 利用生物信息學(xué)方法對(duì)5’末端非編碼區(qū)進(jìn)行分析,該序列中存在TATA框、CAAT框、GC框和一些可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),如Smad3、Smad4、C/EBPβ、MAZF、USF、SP1、AP-2、MEF2、MyoD和HNF-3β/foxa2等。以pGL3-5’UTR為模板構(gòu)建系列缺失表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染LO2和C2C12細(xì)胞,進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測和反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)檢測。與陰性對(duì)照pGL3-basic相比,pGL3-2

4、33、pGL3-416、pGL3-495、pGL3-607和pGL3—690都具有明顯的啟動(dòng)子活性。pGL3-416的活性顯著高于pGL3-233(P<0.05)；pGL3-690的活性顯著高于pGL3-607(P<0.05)。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)結(jié)果與之相符。結(jié)果顯示,AGL5’側(cè)翼序列翻譯起始位點(diǎn)上游218bp開始具有基本啟動(dòng)子活性；-411～-228bp和-685～-602bp的區(qū)段內(nèi)可能有非常重要的順勢(shì)作用元件。
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5、12～-229bp序列分析表明,發(fā)現(xiàn)該區(qū)段含有HNF-3β保守結(jié)合位點(diǎn)。利用重疊延伸PCR技術(shù),以pGL3—690為模板,對(duì)HNF-3β結(jié)合序列進(jìn)行突變,構(gòu)建突變表達(dá)載體pGL3-△-690。分別轉(zhuǎn)染LO2和C2C12細(xì)胞,與pGL3-690相比,pGL3-△-690活性分別下降98％和84％,結(jié)果提示,HNF-3β在AGL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要的作用。
　　 豬AGL5’側(cè)翼序列啟動(dòng)子活性的組織表達(dá)特異性
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