DNA雙鏈斷裂末端的Ku70-80結(jié)合對同源重組修復通路的影響.pdf

1、我們的遺傳物質(zhì)DNA不斷受到諸如化學物質(zhì)、電離輻射和紫外光等外源因素和代謝產(chǎn)物及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等內(nèi)源性因素的損傷。DNA雙鏈斷裂(DNA double strands break，DSB)是最嚴重的DNA損傷之一，未修復或者錯誤修復的DSB會導致基因組重排、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生和免疫缺陷。真核細胞依靠DNA損傷反應(yīng)(DNA damage response，DDR)網(wǎng)絡(luò)通過一系列的信號

2、轉(zhuǎn)導放大，最終走向DNA修復、細胞凋亡或染色體重構(gòu)等結(jié)局來保護基因組的完整性。在DSB發(fā)生時，DDR通過細胞周期阻滯和兩種DSB修復通路：同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(nonhomologous end joining，NHEJ)來進行DNA修復。
　　HR需要同源模板的存在來進行高保真的修復，而NHEJ則使用各種酶直接連接兩個斷裂的末端，因此保真度不如HR，但NHEJ可以連接

3、幾乎任何類型的DSB末端。不同的細胞類型會偏重不同的修復通路，此外，還有兩種因素參與DSB修復通路選擇的調(diào)節(jié)：細胞周期的時期和DNA末端剪切。HR傾向于使用姐妹染色單體作為同源模板，因此被認為只在存在姐妹染色單體的S期和G2期活躍；NHEJ不局限于細胞周期的任何時期.但通常在GO期和G1期占優(yōu)勢。HR需要DNA末端剪切產(chǎn)生的3’端單鏈DNA突出來進行鏈侵入和配對，而NHEJ的發(fā)起因子Ku70/80雖然對于雙鏈DNA(Double str

4、ands DNA，dsDNA)具有很高的親和性，但對于單鏈DNA(single strand DNA，ssDNA)的親和性減弱，因此末端剪切會推動DSB修復向HR方向進行。直接競爭學說認為，在細胞周期的S期和G2期，末端剪切發(fā)起因子MRN(X)(Mrell-Rad50-Nbs1/Xrs2)復合物和Ku70/80直接競爭DSB末端，而MRN首先占據(jù)DSB末端并迅速形成ssDNA來抑制Ku70/80與DSB末端的結(jié)合，從而使HR通路占據(jù)優(yōu)勢

5、。直接競爭學說得到一些證據(jù)支持，但新的數(shù)據(jù)卻發(fā)現(xiàn)Ku70/80對DNA的親和性高于HR，因而該學說可能存在一定問題。因此，我們針對Ku70/80復合物與DSB末端結(jié)合是否有周期依賴性，以及這種結(jié)合對HR的影響展開了研究。
　　我們的實驗中顯示，盡管NHEJ通路主要在G0和G1期占優(yōu)，在哺乳動物細胞的S期當HR作為主要的修復方式時，NHEJ的因子Ku80也可以聚集到DSB位點。并且其初始的聚集和在DSB位點的動力學特征與Ku80在非

6、S期的哺乳動物細胞中相似。我們發(fā)現(xiàn)來自結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的Ku的同源物Mt-Ku可以在S期定位到365 nm脈沖氮氣激光造成的DSB位點，并且可以較長時間滯留，因此我們使用其作為工具來測定哺乳動物細胞中，DSB末端被長時間的阻滯是否會影響DNA末端剪切和HR通路。DNA末端剪切產(chǎn)生的3’突出端會馬上被RPA包被；而BrdU抗體只能識別整合在ssDNA中的BrdU，因此RPA和BrdU焦點的形

7、成就分別被作為ssDNA形成的間接和直接的測量手段。Rad51是介導鏈侵入和配對的不可或缺的HR因子，因此成為廣泛接受的HR修復的標記物。我們在實驗中觀察到，在Ku缺失的嚙齒動物細胞中補充Mt-Ku后，可見電離輻射(ironizing mdiation，IR)損傷后RPA，BrdU和Rad51焦點的形成明顯下降，表明DNA末端剪切和HR介導的DSB修復的下降。HR實驗中Mt-Ku轉(zhuǎn)染細胞相對于未轉(zhuǎn)染細胞HR完成百分比的減少也進一步證實了

8、這一結(jié)論。Mt-Ku轉(zhuǎn)染并不能改善Ku80缺失細胞的IR敏感性，表明Mt-Ku不僅無法介導NHEJ通路的進行，其長期占據(jù)DSB末端也造成了HR修復能力的減弱。
　　我們進一步探求了介導人類Ku70/80從DSB末端解聚的可能機制。實驗室前期的Ku80動力學實驗結(jié)果已表明人類細胞在磷脂酰肌醇3激酶樣蛋白激酶(phosphatidylinositol3-kinase-like protein kinase，PIKKs)家族抑制劑wor

9、tmannin的作用下，激光損傷后120 min Ku80仍可滯留在DSB末端。本研究中的免疫染色實驗數(shù)據(jù)也顯示wortmannin導致了IR后RPA和Rad51焦點形成的減少，揭示了Ku的磷酸化在其解聚中所扮演的角色。為了尋找介導Ku解聚相關(guān)的磷酸化的特異性激酶，我們在激光損傷前使用ATM特異性抑制劑KU-55933和DNA-PKcs特異性抑制劑NU-7441進行處理。NU-7441成功的造成了Ku80在DSB末端的長時間滯留，并且造

10、成了IR后RPA焦點形成的減少。盡管KU-55933單獨作用并不能對Ku80的動態(tài)學特征產(chǎn)生影響，但當與NU-7441聯(lián)合作用時，它們造成了IR后RPA焦點的明顯減少，表現(xiàn)出了明顯增強的DSB末端阻滯效果。這些結(jié)果表明Ku從DSB末端的解聚與DNA-PKcs介導的Ku的磷酸化相關(guān)，并且ATM可以增強DNA-PKcs的磷酸化效果。總而言之，以上數(shù)據(jù)表明了Ku70/80在細胞周期的任何時期都可以與DSB結(jié)合，并在ATM的幫助下經(jīng)由DNA-P