布比卡因致神經(jīng)元DNA損傷及相關(guān)修復(fù)通路激活的研究.pdf

1、局麻布比卡因藥處理神經(jīng)細(xì)胞后，核酸切除修復(fù)酶XPD、堿基切除修復(fù)酶PARP1表達(dá)顯著性增高。由此推測，以上2條通路可能是局麻藥致神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后的重要修復(fù)途徑。明確上述假設(shè)，闡明該損傷后修復(fù)機(jī)制可為更精準(zhǔn)、有效防治局麻藥致神經(jīng)毒性損傷提供新的思路和靶點。
　　為論證以上假說，該研究擬采用離體細(xì)胞實驗及在體動物研究兩部分，采用多種分子生物學(xué)技術(shù)，分別從以下四章進(jìn)行論述:
　　第一章 研究布比卡因致神經(jīng)細(xì)胞毒性反應(yīng)和DNA損

2、傷情況
　　目的:建立細(xì)胞和大鼠的布比卡因?qū)е律窠?jīng)毒性損傷和DNA損傷模型，探討布比卡因致神經(jīng)細(xì)胞毒性反應(yīng)和DNA損傷情況
　　方法:1.細(xì)胞模型
　　首先采用不同濃度的布比卡因處理SH-SY5Y細(xì)胞，CCK-8檢測細(xì)胞活力計算布比卡因的IC50值，LDH檢測各組的細(xì)胞毒性情況，選取該IC50值作為后續(xù)細(xì)胞模型的濃度;應(yīng)用布比卡因的IC50值濃度處理SH-SY5Y細(xì)胞3小時后，換成正常培養(yǎng)基再孵育24小時作為損傷模型組

3、，分別用Hochest-33258、TUNEL劑盒檢測細(xì)胞凋亡，JC-1檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化，DHE檢測細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，彗星實驗測定細(xì)胞的DNA損傷情況。Western bolt測定凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2比值、cleave-caspase3表達(dá)，DNA損傷標(biāo)志蛋白p-γH2ax表達(dá)。
　　2.動物模型
　　我們選用SD大鼠鞘內(nèi)置管后，注射3％布比卡因作為動物損傷模型;脊髓組織HE染色觀察神經(jīng)元病理改變;ELI

4、SA檢測氧化損傷產(chǎn)物丙二醛(MDA)與氧化DNA損傷指標(biāo)8羥基脫氧鳥苷(8-oxodG); TUNEL法和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-1/Bax比值檢測脊髓組織神經(jīng)元凋亡情況;Western blot檢測各組大鼠脊髓組織DNA損傷指標(biāo)-γH2ax蛋白的磷酸化水平;通過大鼠足底光熱刺激潛伏期(PWTL)、機(jī)械痛縮足閾值(PWMT)檢測來說明動物對熱痛、機(jī)械痛刺激的敏感程度;從行為學(xué)上判斷大鼠的脊髓神經(jīng)功能受損傷情況。
　　結(jié)果:1.細(xì)胞模型

5、
　　CCK-8法檢測布比卡因不同濃度各組細(xì)胞活力,結(jié)果顯示:不同濃度布比卡因處理細(xì)胞后，布比卡因的IC50值（半抑制濃度）=1.5mM;LDH試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH的含量結(jié)果顯示:與對照組比較，從Bup1.5mM濃度組開始細(xì)胞毒性明顯增高(*p＜0.05)，布比卡因的細(xì)胞毒性呈濃度依賴性;Hochest-33258、TUNEL檢測各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示:1.5mM布比卡因處理細(xì)胞后可導(dǎo)致SH-SY5Y細(xì)胞凋亡比例增

6、加（*p＜0.05），凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比值降低，凋亡蛋白cleave-easpase3表達(dá)增多（*p＜0.05）;。
　　2.動物模型
　　脊髓組織HE結(jié)果顯示對照組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。ELISA試劑盒檢測各組大鼠脊髓組織均漿上清中8-oxo-dG的含量結(jié)果顯示:與對照組比較，模型組8-oxo-dG含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與對照組比較，模型組脊髓組織γH2ax蛋白的磷酸化水

7、平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);行為學(xué)結(jié)果顯示:與對照組比較，模型組大鼠機(jī)械痛縮足閾值(PWMT)和大鼠足底光熱刺激潛伏期(PWTL)值均增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:本章實驗證實:布比卡因可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡比例增高，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增高，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高，線粒體膜電位改變，DNA損傷加重。
　　第二章 基因和蛋白組學(xué)篩查探討局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)元DNA損傷后其相關(guān)修復(fù)

8、通路中關(guān)鍵修復(fù)酶的變化
　　目的:通過基因和蛋白組學(xué)篩查探討局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)元DNA損傷后其相關(guān)修復(fù)通路中關(guān)鍵修復(fù)酶的變化
　　方法:首先建立布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞SH-SY5Y毒性損傷模型，應(yīng)用cDNA微孔板陣列技術(shù)做關(guān)于DNA損傷修復(fù)通路中的一些重要的調(diào)控因子和修復(fù)酶的基因篩查.
　　結(jié)果:cDNA微孔板實驗結(jié)果顯示:與對照組細(xì)胞比較，布比卡因處理后差異表達(dá)基因統(tǒng)計如下:DNA-PKcs、PTEN、NTH1、RAD9

9、、CSB、GADD45、XPD、XPC-HR23B、P53;分析得出，這些修復(fù)基因主要集中在以下3修復(fù)機(jī)制:1.堿基切除修復(fù);2.核酸切除修復(fù);3.非同源重組修復(fù)。
　　iTRAQ蛋白組學(xué)篩查結(jié)果顯示:與對照組細(xì)胞比較，布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)細(xì)胞DNA損傷后被激活的損傷修復(fù)酶大多集中在堿基切除修復(fù)通路(polδ、ploβ、PARP)和核酸切除修復(fù)通路(HR23B、RFC、polδ、XPD)上。
　　結(jié)論:通過eDNA微孔板和iT

10、RAQ蛋白組學(xué)篩查，我們發(fā)現(xiàn)局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷后差異表達(dá)的修復(fù)蛋白主要集中在以下2條修復(fù)機(jī)制:1.堿基切除修復(fù);2.核酸切除修復(fù)。
　　第三章 局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路及關(guān)鍵差異修復(fù)酶的表達(dá)驗證
　　目的:基于上一章基因和蛋白組學(xué)篩查的結(jié)果，驗證篩查得到的局麻藥導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路及關(guān)鍵差異修復(fù)酶XPD、PARP-1的表達(dá)。
　　方法:1.細(xì)胞模型應(yīng)用1.5mM布比卡因處理SH—SY5

11、Y細(xì)胞后觀察3h，6h,12h，24h不同時間點關(guān)鍵DNA損傷修復(fù)基因(XPD、PARP-1)的mRNA和蛋白表達(dá)情況;Q-PCR驗證布比卡因?qū)е碌腟H-SY5Y細(xì)胞DNA損傷模型中關(guān)鍵修復(fù)基因XPD、PARP-1的mRNA的表達(dá)情況;Western blotting檢測布比卡因?qū)е碌腟H-SY5Y細(xì)胞DNA損傷模型中關(guān)鍵修復(fù)酶XPD、PARP-1的蛋白表達(dá)情況;
　　2.動物模型采用第一章節(jié)建立的大鼠鞘內(nèi)注射3％布比卡因24小時

12、后取材為動物損傷模型，Western blotting檢測大鼠脊髓組織XPD修復(fù)酶的蛋白表達(dá)Western blotting和免疫組化(IHC)檢測大鼠脊髓神經(jīng)DNA損傷模型中“關(guān)鍵修復(fù)酶”XPD、PARP-1的表達(dá)情況;
　　結(jié)果:1.細(xì)胞模型qPCR檢測細(xì)胞XPD修復(fù)酶mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示:與對照組細(xì)胞比較，布比卡因處理后不同時間點XPD酶的mRNA表達(dá)均上升，統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);qPCR檢測細(xì)胞PARP-1修復(fù)酶

13、mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示:與對照組細(xì)胞比較，布比卡因處理后不同時間點PARP-1酶的mRNA表達(dá)均上升，統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);Western blotting檢測細(xì)胞XPD修復(fù)酶的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與對照組細(xì)胞比較，布比卡因處理后不同時間點XPD酶的蛋白表達(dá)均上升，但是3h時升高沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，其他時間點XPD蛋白表達(dá)升高均有統(tǒng)計學(xué)差異(*P＜0.05);Western blotting檢測細(xì)胞PARP-1修復(fù)酶

14、的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與對照組細(xì)胞比較，布比卡因處理后3h PARP-1蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，其他時間點PARP-1的蛋白表達(dá)均上升，有統(tǒng)計學(xué)差異（*P＜0.05）。
　　2.動物模型Western blotting檢測大鼠脊髓組織XPD修復(fù)酶的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與對照組相比，損傷模型組大鼠脊髓組織中XPD蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;檢測大鼠脊髓組織PARP-1修復(fù)酶的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示:與對照組相比，損

15、傷模型組大鼠脊髓組織中PARP-1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）.
　　結(jié)論:布比卡因?qū)е律窠?jīng)元DNA損傷后會激活核酸切除修復(fù)通路(關(guān)鍵酶XPD)和堿基切除修復(fù)通路（關(guān)鍵酶PARP-1），該部分結(jié)果與eDNA微孔板和iTRAQ蛋白組學(xué)關(guān)于DNA損傷修復(fù)通路的篩查結(jié)果一致。
　　第四章 局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路及關(guān)鍵差異修復(fù)酶的功能作用驗證
　　目的:驗證局麻藥導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷

16、模型中篩查出的修復(fù)通路及關(guān)鍵差異修復(fù)酶的功能作用
　　方法:通過XPD低表達(dá)慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞并建立低表達(dá)XPD的SH-SY5Y細(xì)胞株;在GV211-RNAi慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞低表達(dá)XPD酶后，采用彗星實驗和Western blotting檢測的DNA損傷標(biāo)志性蛋白γ-H2ax磷酸化水平來評價該模型中細(xì)胞DNA損傷修復(fù)情況，LDH檢測該模型中細(xì)胞毒性情況，AnnexinⅤ-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋

17、亡比例，Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá).
　　結(jié)果:XPD-RNAi(31535)組的干擾慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞后XPD的mRNA和蛋白水平均表達(dá)顯著性降低(p＜0.05);與模型組比較，布比卡因處理低表達(dá)XPD-SHSY5Y細(xì)胞組，DNA損傷明顯加重，彗星實驗相關(guān)損傷指標(biāo)尾距(Olive tail moment)明顯增高(p＜0.05);DNA損傷標(biāo)志性蛋白γ-H2ax磷酸化水平明顯增高（*p＜0.