人過氧化氫酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達(dá).pdf

1、生物體在新陳代謝中，細(xì)胞有氧呼吸所消耗的O2約10％被還原成H2O2。后者很容易被細(xì)胞中各種還原劑還原成·OH和OH-，而·OH是極毒的羥自由基，能氧化與它接觸的幾乎所有細(xì)胞組份，引起衰老、癌變及其它病癥。生物體內(nèi)存在的過氧化氫酶（catalase，CAT）能有效地催化細(xì)胞中產(chǎn)生的高濃度H2O2（2H2O2→O2+2H2O），從而防止自由基對細(xì)胞的損傷。此外，CAT具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。目前商品化的過氧化氫酶主要來源于牛肝、微球菌和黑

2、曲霉，主要用于工業(yè)生產(chǎn)。對于醫(yī)藥和保健來說，人源的CAT應(yīng)用價值更高。本研究利用基因重組技術(shù)實現(xiàn)人CAT基因在大腸桿菌中實現(xiàn)了有生物活性的表達(dá)，為其開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。
　　 本實驗使用人cDNA文庫，利用嵌套式PCR技術(shù)，獲得了編碼人CAT基因完整讀碼框的cDNA序列，選用pMAL-c2x、pBV221質(zhì)粒作為載體，經(jīng)過定向克隆將人CAT基因分別構(gòu)建了融合pMAL-c2x-CAT和非融合表達(dá)載體pBV-CAT，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌

3、TB1和JM109中實現(xiàn)表達(dá)。
　　 在融合表達(dá)中，分別選擇了37℃、28℃、20℃作為不同誘導(dǎo)溫度對pMAL-c2x-CAT重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。隨著溫度的降低，可溶性目的蛋白的表達(dá)量逐步增加，12h誘導(dǎo)后表達(dá)產(chǎn)物可占總菌蛋白的23％。該表達(dá)產(chǎn)物（MBP-CAT）經(jīng)親和層析純化后并未表現(xiàn)出CAT活性。用Factor Xa將MBP蛋白切掉后，產(chǎn)物明顯具有CAT活性，說明MBP蛋白的存在可能影響了CAT蛋白的正確折疊，從而影響了它的

4、酶學(xué)活性。而在pBV221-CAT非融合表達(dá)體系中，經(jīng)溫度誘導(dǎo)后，目的蛋白不僅呈可溶性，且具有CAT活性，但表達(dá)量較低。
　　 在目的蛋白的活性測定中，本文采用了KMnO4染色法和紫外分光光度法進(jìn)行活性測定。KMnO4染色法方法簡便直觀，易操作，特異性好，但不適用于活性定量測定；而紫外分光光度法檢測速率快，靈敏度高，操作簡便，適于過氧化氫酶活性的快速定量測定。
　　 本研究還對重組酶的性質(zhì)進(jìn)行了研究（酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)