SELEX-Seq技術(shù)繪制轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合譜的方法學(xué)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜是指轉(zhuǎn)錄因子能夠特異性識(shí)別并結(jié)合的所有DNA序列及其相對(duì)親合性，它對(duì)于研究轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合特異性和預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子DNA靶點(diǎn)及靶基因都具有重要意義。目前繪制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜的方法可分為體內(nèi)和體外兩種，其中將指數(shù)富集配體進(jìn)化技術(shù)(SELEX)與DNA高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的SELEX-Seq技術(shù)已經(jīng)成為繪制轉(zhuǎn)錄因子DNA體外結(jié)合譜的首選方法。
　　 核因子κB(NF-κB)是一種調(diào)控性真核轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫

2、應(yīng)答和腫瘤發(fā)生等關(guān)系密切，是目前進(jìn)行轉(zhuǎn)錄治療和藥物篩選的重要靶點(diǎn)。因此本論文采用基于電泳遷移率變動(dòng)分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)的SELEX-Seq技術(shù)繪制了NF-κBp50蛋白的高分辨率DNA結(jié)合譜，設(shè)計(jì)并論證了一套新的SELEX-Seq實(shí)驗(yàn)技術(shù)體系，為研究其他轉(zhuǎn)錄因子DNA體外結(jié)合譜提供切實(shí)可行的研究方法。
　　 實(shí)驗(yàn)中首先設(shè)計(jì)并合成了三種序列:陽(yáng)性序列、陰性序列和篩選序列，其中篩選序列是含有16bp隨機(jī)序列的單鏈寡核苷酸，序列兩端為

3、PCR引物退火恒定序列。陽(yáng)性序列和陰性序列的結(jié)構(gòu)基本上同篩選序列，但兩端帶有不同于篩選序列的PCR引物退火序列;陽(yáng)性序列的中間為NF-κB的一個(gè)已知結(jié)合序列（野生型序列），而陰性序列的中間為野生型序列的突變序列，與NF-κB不結(jié)合。SELEX篩選前，先將三種單鏈寡核苷酸序列用單引物退火、Klenow酶延伸的方法，轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈寡核苷酸。之后采用基于EMSA的SELEX技術(shù)篩選并富集與NF-κBp50蛋白結(jié)合的DNA分子，對(duì)富集的DNA分子再

4、進(jìn)行PCR擴(kuò)增作為下一輪篩選的文庫(kù)。在隨機(jī)序列的每輪SELEX篩選中加入陽(yáng)性序列和陰性序列，對(duì)篩選產(chǎn)物進(jìn)行陽(yáng)性序列和陰性序列的分別PCR擴(kuò)增，判斷篩選的特異性。經(jīng)4輪SELEX篩選富集后，對(duì)各輪篩選富集的帶有標(biāo)簽的DNA分子用近紅外EMSA實(shí)驗(yàn)和低通量克隆測(cè)序進(jìn)行分析驗(yàn)證。最后，將各輪篩選樣品合并進(jìn)行Hiseq2000高通量測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以獲得轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp50蛋白高分辨率DNA體外結(jié)合譜:序列頻率統(tǒng)計(jì)獲得N

5、F-κBp50對(duì)各種DNA序列的相對(duì)結(jié)合親合性;對(duì)各輪篩選和測(cè)序產(chǎn)物隨機(jī)抽樣，進(jìn)行MEME分析，獲得NF-κBp50DNA結(jié)合模體。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)運(yùn)用EMSA技術(shù)能夠篩選轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)合序列;(2)隨機(jī)抽樣MEME可有效提取轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合模體;(3)基于EMSA的SELEX-Seq可有效地繪制轉(zhuǎn)錄因子DNA體外結(jié)合譜;(4)運(yùn)用SELEX-Seq方法建立的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜可為后續(xù)DNA結(jié)合靶點(diǎn)及靶基因的預(yù)測(cè)和鑒定