新型功能化DNA探針用于轉(zhuǎn)錄因子的熒光生物傳感研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factors，TFs)是一類序列特異性DNA結(jié)合蛋白(DNA-binding proteins)，通過結(jié)合基因調(diào)控區(qū)域中特定的雙鏈DNA序列(dsDNA)調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。人類細(xì)胞中存在大約1400種轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的正常變化對于細(xì)胞發(fā)育，分化和增長等細(xì)胞過程是必不可少的。但轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的異常變化將會導(dǎo)致發(fā)育障礙，異常激素反應(yīng)，炎癥和癌癥等一系列疾病。它們的表達(dá)水平靈敏地反映細(xì)胞發(fā)

2、展和疾病狀態(tài)。因此，轉(zhuǎn)錄因子已被做為臨床診斷和藥物開發(fā)的潛在目標(biāo)物。靈敏檢測轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平對于闡明基因調(diào)控機(jī)制，臨床診斷和藥物開發(fā)具有重要意義。
　　轉(zhuǎn)錄因子的檢測方法中，熒光檢測方法具有操作簡單、安全和靈敏度高的優(yōu)勢，獲得廣泛應(yīng)用。其中，識別探針構(gòu)象轉(zhuǎn)變法是最常用的一種轉(zhuǎn)錄因子的熒光檢測方法。此法是利用轉(zhuǎn)錄因子與識別探針發(fā)生特異性結(jié)合后，導(dǎo)致識別探針的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而引起熒光信號的變化，實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)錄因子的檢測，此法檢測步驟簡便

3、、快速，但識別探針的設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，應(yīng)用范圍受到限制。
　　本論文以上述科學(xué)問題為研究目標(biāo)，構(gòu)建了2種多功能DNA探針，建立了2種解決方案。主要內(nèi)容歸納如下:
　　1.中性pH環(huán)境中Ag+隱定的自組裝triplex DNA分子開關(guān)(Ag+-stabilizedself-assembly triplex DNA molecular switch，Ag+-STDMS)用于轉(zhuǎn)錄因子的靈敏檢測
　　近年來，三螺旋DNA(trip

4、lex DNA)已被廣泛應(yīng)用于序列特異性標(biāo)記，調(diào)控基因表達(dá)以及構(gòu)建基于DNA的納米結(jié)構(gòu)領(lǐng)域。其中，包含C+·G。C和T·A。T（·代表Hoogsteen氫鍵，代表Watson-Crick氫鍵）的triplex DNA最為常用。在triplex DNA的形成過程中，含有同型嘧啶鏈（胞嘧啶C和胸腺嘧啶T）的寡核苷酸（稱之為triplex-forming oligonucleotides，TFO）需要質(zhì)子化后才能結(jié)合雙鏈DNA的嘌呤鏈（含有腺

5、嘌呤A和鳥嘌呤G），進(jìn)而形成triplex DNA。因此，這種triplex DNA只能在弱酸性環(huán)境中形成及存在，極大地限制了它的應(yīng)用范圍。Ag+能夠特異性地結(jié)合triplex DNA中的C+·G。C，并將C+·G。C中的H+置換形成Ag+C·G。C，使triplex DNA能夠在中性及弱堿性環(huán)境中穩(wěn)定存在，這極大拓寬了triplex DNA的應(yīng)用領(lǐng)域。考慮到細(xì)胞中存在的許多轉(zhuǎn)錄因子的識別雙鏈均富含G-C堿基對（例如，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ

6、B p50），因此，我們構(gòu)建了一種中性pH環(huán)境中Ag+穩(wěn)定的自組裝triplex DNA分子開關(guān)（Ag+-STDMS），成功應(yīng)用于NF-κB p50及實(shí)際生物樣品的靈敏檢測，檢測限(LOD)分別為25pM和0.8ng/μL，優(yōu)于現(xiàn)有的一些檢測方法。此外，本文提出的檢測方法檢測步驟簡便、快速。Ag+-STDMS易于設(shè)計(jì)，只要簡單地改變相應(yīng)的組成序列即可用于其它轉(zhuǎn)錄因子的靈敏檢測，具有通用性。
　　2.GO熒光開關(guān)輔助的多功能發(fā)夾探針

7、(muitifunctional G-quadruplex-hairpinprobe，MGHP)用于轉(zhuǎn)錄因子的免標(biāo)記、靈敏檢測
　　氧化石墨烯(GO)作為一種水溶性單原子厚度二維納米材料，由于其獨(dú)特的電子、機(jī)械和熱力學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。它能夠通過非共價(jià)π-π堆疊相互作用吸附單鏈DNA，并能猝滅標(biāo)記在單鏈DNA上的熒光團(tuán)的熒光。與有機(jī)猝滅劑或其它納米材料相比，GO具有優(yōu)越的淬火效率，已被用于開發(fā)多種生物傳感器。本文中我們利用G

8、O的高效吸附作用和熒光猝滅屬性，設(shè)計(jì)了一種具有三重功能（環(huán)部單鏈吸附于GO表面，莖部雙鏈結(jié)合目標(biāo)物轉(zhuǎn)錄因子，末端G四倍體作為信號載體）的發(fā)夾探針（MGHP），構(gòu)建了一種簡單、免標(biāo)記的熒光檢測方法，實(shí)現(xiàn)了對NF-κBp50及實(shí)際樣品的的靈敏檢測，LOD分別為0.2nM和7.8ng/μL。
　　在疾病的早期階段，轉(zhuǎn)錄因子顯示相對較低的表達(dá)水平，因此，通過適當(dāng)?shù)男盘柗糯蠹夹g(shù)對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行高靈敏檢測對于疾病的早期診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。外

9、切酶切割輔助擴(kuò)增法是一種常用的轉(zhuǎn)錄因子的熒光放大檢測方法。此法是利用外切酶(ExoⅠ、ExoⅢ)能夠切割單鏈DNA、雙鏈DNA的特性，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與識別探針結(jié)合形成復(fù)合物后，切割去除過量的識別探針。形成的復(fù)合物進(jìn)入后續(xù)信號放大過程，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的高靈敏檢測。此法靈敏度高，但需要借助一種或兩種外切酶切割去除過量的識別探針，切割不完全易引起假陽性信號。
　　本論文以上述科學(xué)問題為研究目標(biāo)進(jìn)一步構(gòu)建了2種多功能DNA探針，建立了2種解決方

10、案。主要內(nèi)容歸納如下:
　　3.共區(qū)域化識別激活的級聯(lián)鏈置換擴(kuò)增用于轉(zhuǎn)錄因子的高靈敏檢測
　　結(jié)合誘導(dǎo)DNA鏈的共區(qū)域化，進(jìn)而觸發(fā)DNA組裝已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。其中，目標(biāo)物結(jié)合觸發(fā)的鏈置換是最常見的一種組裝途徑。在本文中，將目標(biāo)物轉(zhuǎn)錄因子的識別序列分裂為三個小片段DNA，稱之為分裂識別組件，構(gòu)建一種轉(zhuǎn)錄因子的新型識別方式-共區(qū)域化識別。目標(biāo)物識別三個分裂識別組件，使其發(fā)生共區(qū)域化，進(jìn)而激活后續(xù)級聯(lián)的鏈置換擴(kuò)增和指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增，實(shí)

11、現(xiàn)了對NF-κBp50及實(shí)際樣品的的高靈敏檢測，LOD分別為0.25pM和0.04ng/μL，優(yōu)于現(xiàn)有的大多數(shù)檢測方法。更重要的是，反應(yīng)中過量的分裂識別組分在試驗(yàn)溫度(37℃)無法自行雜交成穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的信號放大過程，因此，不需要任何外切酶的參與去切割過量的分裂識別組件，消除了過量識別探針去除不完全引起的假陽性信號。
　　4.協(xié)同的掩蔽效應(yīng)和結(jié)合保護(hù)效應(yīng)介導(dǎo)的級聯(lián)鏈置換擴(kuò)增用于轉(zhuǎn)錄因子的高靈敏檢測
　　堿基互補(bǔ)配

12、對雜交是DNA的基本性質(zhì)，具有互補(bǔ)堿基的單鏈DNA能夠快速而徹底地配對雜交成為穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。無機(jī)化學(xué)中的掩蔽反應(yīng)是最常用的去除雜質(zhì)的手段。在本章中，將掩蔽效應(yīng)應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域，設(shè)計(jì)了與識別探針互補(bǔ)的DNA掩蔽鏈，去除過量發(fā)夾識別探針，獲得了較好的掩蔽效果，反應(yīng)不需要任何外切酶的參與去切割過量的識別探針，消除了過量識別探針去除不完全引起的假陽性信號。同時(shí)利用目標(biāo)物的結(jié)合保護(hù)效應(yīng)，觸發(fā)級聯(lián)擴(kuò)增，對NF-κBp50及實(shí)際樣品進(jìn)行高靈敏檢測