應(yīng)用SELEX技術(shù)體外篩選PRRSV核衣殼蛋白的DNA適配子.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起豬繁殖與呼吸綜合征，俗稱“藍(lán)耳病”。該病1987年最早報(bào)道于美國(guó)，1991在荷蘭分離到病毒，我國(guó)大陸哈爾濱獸醫(yī)研究所于1996年首次報(bào)道并分離到病原，目前該病流行于世界各養(yǎng)豬國(guó)家，給世界養(yǎng)豬也帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV不分節(jié)段單股正鏈的RNA病毒，為尼多目動(dòng)脈炎病毒屬，成熟病毒粒子直徑約50-60nm，有囊膜?；蚪M全長(zhǎng)約15kb，共有9個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs）。ORF7編碼約15kDa的核衣

2、殼(N)蛋白。N蛋白在病毒表達(dá)的蛋白中含量高，有4-5個(gè)抗原決定簇，免疫原性極強(qiáng)，因此非常適合用于疾病診斷。
　　 指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，SLEXE)技術(shù)是上世紀(jì)九十年代產(chǎn)生的一種新型組合化學(xué)技術(shù)。應(yīng)用SELEX技術(shù)可以從一個(gè)大容量隨機(jī)寡聚核苷酸文庫(kù)中篩選針對(duì)靶物質(zhì)的親和性和特異性的適配子。本實(shí)驗(yàn)首次運(yùn)用SELEX技術(shù)篩選特

3、異性針對(duì)PRRSVN蛋白的ssDNA適配子。通過(guò)測(cè)定適配子與N蛋白的親和性和專一性，評(píng)估適配子應(yīng)用于PRRSV的早期診斷價(jià)值。主要研究?jī)?nèi)容包括:
　　 1.PRRSV核衣殼蛋白的表達(dá)純化
　　 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-PRRSV-N轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下大量表達(dá)帶有6個(gè)his標(biāo)簽的PRRSVN蛋白，通過(guò)Ni-NTA柱純化后，PAGE鑒定，得到高純度的融合表達(dá)蛋白。
　　 2

4、.合成初始隨機(jī)寡聚核苷酸文庫(kù)及引物
　　 體外化學(xué)合成一個(gè)中間具有40個(gè)隨機(jī)核苷酸序列的大容量初始隨機(jī)寡聚核苷酸(ssDNA)文庫(kù)，隨機(jī)區(qū)兩端帶有18nt固定序列，該文庫(kù)含有大量的序列(1015)。引物根據(jù)兩端固定序列區(qū)設(shè)計(jì)，用于SELEX篩選中次級(jí)文庫(kù)的克隆。
　　 3.SELEX過(guò)程
　　 在SELEX過(guò)程中，將初始文庫(kù)轉(zhuǎn)化成dsDNA，作為模板用不對(duì)稱PCR擴(kuò)增生成ssDNA文庫(kù)，ssDNA文庫(kù)先與空白微孔

5、，PRRSVGP5或陰性血清孵育以減少非特異性序列的富集，再與固定在微孔板上的N蛋白孵育，洗脫特異性結(jié)合序列。在下一輪篩選中，洗脫的ssDNA序列作為模板生成dsDNA，然后再生成ssDNA文庫(kù)，依次進(jìn)行篩選和洗脫，周而復(fù)始。本實(shí)驗(yàn)共完成15輪篩選。將最后得到的特異性序列克隆至pGEM(@)-TVector，轉(zhuǎn)化DH5α，我們挑取了34個(gè)單克隆菌落。經(jīng)雙酶切鑒定和PCR方法鑒定，測(cè)序，獲得26個(gè)親和性適配子序列。
　　 4.適配

6、子功能分析
　　 生物素標(biāo)記的適配子作為“一抗”，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素作為“二抗”，用ELISA的方法檢測(cè)適配子和PRRSVN蛋白之間的親和性和特異性，顯示得到針對(duì)N蛋白的24個(gè)親和性和特異性適配子，一些適配子具有親和PRRSV特性。堿基組成分析顯示26條適配子序列均富含C或T，這可能與親和PRRSV核衣殼蛋白有關(guān)。序列比對(duì)分析表明有7個(gè)序列出現(xiàn)2次，若干序列之間具有保守的片段。應(yīng)用DNAMAN軟件模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)，保守序