抑制Dicer的表達(dá)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中CpG島甲基化的影響.pdf

1、Dicer是siRNA生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。研究表明Dicer能夠在很多物種中調(diào)節(jié)異染色質(zhì)的形成，影響DNA甲基化和組蛋白修飾，但是，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Dicer是否具有類似的功能，目前尚不十分清楚。
　　目的：
　　本文旨在研究Dicer對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因啟動(dòng)子的CpG島DNA甲基化的調(diào)節(jié)及相應(yīng)蛋白編碼基因表達(dá)的影響，并初步探討在Dicer低表達(dá)的細(xì)胞中，基因啟動(dòng)子的CpG島DNA甲基化的水平與基因表達(dá)水平的相關(guān)性。

2、>　　方法：
　　1.用人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116構(gòu)建Dicer低表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系，通過(guò)RT-PCR及westernblot鑒定陽(yáng)性克隆。
　　2.在HCT116細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Dicer siRNA抑制Dicer的表達(dá)，用RT-PCR及western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。
　　3.在穩(wěn)轉(zhuǎn)及瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞中用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)水平。用Bisulfitesequencing技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中基因啟動(dòng)子CpG島的甲基化水

3、平。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了Dicer低表達(dá)的HCT116穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　2.在抑制Dicer表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系中，CPEB2、ICAM-1、LHFP、LIPG、PELI2、SERTAD4、RTN1、SFRP4的mRNA水平增加，LHFP和ICAM-1的CpG島的DNA甲基化水平降低。
　　3.在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Dicer siRNA的HCT116細(xì)胞中，抑制Dicer的表達(dá)能夠誘導(dǎo)CPEB2、PELI2、RTN